新型含三唑异吲哚类微管蛋白抑制剂的设计、合成及生物活性研究

Protein active site three-dimensional structure-based design is one of the most effective methods for the discovery of new drugs. On basis of the three-dimensional structure of tubulin in colchicine binding site, and with the in-depth understanding of tubulin-ligand model, this project will use a novel isoindole compound TR-32 which has been found to have potent and broad antitumor activity by our research group as a lead structure, to make structural reconstruction and modification and evaluate their biological activities. By means of structural characterization and biological activities, the three-dimensional quantitative structure activity relationship should be studied using comparative molecular field analysis (CoMFA) and comparative molecular similarity index analysis (CoMSIA) methods, and the influence of steric and electrostatic effects of substituents on antitumor activity of the target compounds can be investigated. This project will help to further clarify the structure-activity relationship of tubulin inhibitor in colchicine binding site, and provide a theoretical and experimental basis to develop novel tubulin inhibitors or to discover potential antitumor drug candidates.

基于蛋白质活性部位的三维结构创制药物是发现新药的最有效方法之一。本项目根据微管蛋白秋水仙碱结合位点的三维结构特征，在深入理解微管蛋白与配体结合模型的基础上，选择申请人前期发现的结构新颖且对多种肿瘤细胞株都具有较高抑制活性的含三唑异吲哚衍生物TR-32为先导结构，分别对化合物中的三个关键结构部位进行改造和修饰，并进行活性测试。在此基础上，采用比较分子场分析法（CoMFA）和比较分子相似性指数分析法（CoMSIA）系统研究所设计并合成的目标化合物的三维定量构效关系，探讨取代基的立体效应和静电效应对其抗肿瘤活性的影响，以期筛选出化学结构新颖，抗肿瘤活性高的新型微管蛋白抑制剂。本研究的实施将有利于进一步明确作用于秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂的构效关系，为创制新型微管蛋白抑制剂提供理论指导或发现结构新颖的具有潜在药用前景的抗肿瘤候选药物。

本项目以课题组前期发现的较高活性化合物TR-32为先导结构，采用分子骨架跃迁、生物电子等排以及计算机辅助药物设计等策略，设计合成了五个不同结构类型共171个未见文献报道的化合物，并确证其结构。此外，对所合成的目标化合物的药理活性进行了深入的研究，采用 MTT法，考察了所有目标化合物对HepG2、HCT116、PC-3、HeLa、HT29、A549、MDA-MB-231及MCF-7的体外细胞毒性，发现多个化合物的肿瘤抑制活性与阳性对照CA-4相当，尤其是化合物Ⅳ-31的活性最为突出，对HT29、A549的抑制活性的IC50分别为23、50 nM，明显优于阳性对照。体外酶水平抑制微管蛋白聚合的实验研究表明，多个化合物对微管蛋白聚合抑制活性的IC50与阳性对照相当，而化合物Ⅳ-31的IC50为1.6 μM，明显优于CA-4。对候选化合物Ⅳ-31进行了深入的作用机制研究。流式细胞术检测表明，Ⅳ-31在10-20 nM浓度下对A549细胞细胞周期有明显的阻滞作用，且发生在G2/M期；采用蛋白免疫印迹实验（WB）检测了相关周期和凋亡蛋白；进一步的免疫荧光试验表明，该化合物可与微管蛋白结合，这一研究也被分子对接模型得以证实，初步阐明了该类化合物的作用机制，为潜在的靶向作用于秋水仙碱结合位点的微管聚合抑制剂。该研究为抗微管药物的研究提供了一类有潜力的分子探针，具有重要的进一步研究价值。本项目迄今已发表SCI论文10篇，申请中国发明专利2项，已培养硕士研究生3名，在读硕士研究生2名。