外泌体HSP70蛋白适配子的筛选及其抗肿瘤免疫逃逸作用的研究

HSP70 has been proved as the series of highly malignant proteins which are overexpressed in glioma cells. In the tumor microenvironment, HSP70 that expressed on the exosome surface and released from tumor cell can firmly bind with the Toll-like receptor 2(TLR2) on the immunosuppressive cells,thereby activate them. And then mediate the immune escape and proliferation of tumor cells. Although many anti-HSP70 inhibitors have been synthesized, they are still facing challenges in the clinical applications due to their poor affinity and low biological value. Aptamers(ss-DNA or ss-RNA),also knows as artificial antibodies, is the most highly hopeful candidates to bind target molecules with high affinity and selectivity. This project will select DNA aptamers against HSP70 protein for targeting glioma cell-derived exosomes by using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) technology. The aptamers will be used for glioma immunotherapy by preventing the immunosuppressive function of HSP70. In addition, the aptamers will be further modified with fluorescent agent for the real-time supervision of the immunotherapeutic process in vivo by molecular imaging technology. All these research will promote aptamers as efficient agents for cancer immunotherapy, offering theoretic and experimental evidence.

研究表明热休克蛋白HSP70是一类在胶质瘤细胞中过表达的高度恶性相关蛋白，主要经由外泌体膜携带，通过与肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞上的TLR2受体结合，介导胶质瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤增殖。尽管目前已合成了诸多针对HSP70蛋白的抑制剂，然而这些抑制剂普遍存在亲和力差，效价低等缺陷。适配子因其具有与靶蛋白的高度亲和力及良好的生物相容性成为研究热点。本项目拟利用SELEX技术筛选针对胶质瘤外泌体上HSP70蛋白的DNA适配子，通过抑制HSP70蛋白的功能，阻断HSP70介导的免疫抑制作用，达到对胶质瘤免疫治疗的目的。同时，通过构建荧光探针修饰的适配子体系，运用分子成像技术，在动物肿瘤模型中，实现对靶向体系发挥免疫治疗过程的非侵入实时监测。本项目有望为开发胶质瘤的免疫治疗药物提供理论基础和实验依据。

热休克蛋白（Heat shock protein 70，HSP70）是一类分子伴侣蛋白，当细胞受到外界氧化应激压力时，其表达量升高，有修复细胞内错误折叠蛋白的作用。HSP70在多种肿瘤细胞中过表达，并且与肿瘤不良预后和化疗耐药有着直接的关系。肿瘤细胞释放的外泌体携带有大量的HSP70，一方面，这些外泌体HSP70与肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞上的TLR2受体结合，导致肿瘤细胞免疫逃逸，促进肿瘤增殖；另一方面，细胞外HSP70充当损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP），加剧化疗药物阿霉素（Doxorubicin）的心脏损伤毒性。据报道，抑制HSP70，可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。目前已合成了诸多针对HSP70蛋白的抑制剂，然而这些抑制剂普遍存在亲和力差，效价低等缺陷。近来开发的针对HSP70的蛋白肽虽然生物相容性好，亲合力高，但是存在细胞渗透性差，常用比较复杂的方法，如转染或者纳米载体等来递送肽。.近年来，DNA核酸适配体因其具有与靶蛋白的高度亲和力及易于修饰改造等优点成为研究热点，不仅可以作为靶向肿瘤的载体，还能偶联药物小分子及其他生物大分子，将所携带的药物分子递送进入靶细胞后，药物分子发挥生物功能。一方面，解决了药物的靶向递送问题，使得偶联药物富集在病变部位如肿瘤组织中，另一方面，减少了药物的副作用。基于此，经过三年多的研究，我们在体外构建了靶向HSP70蛋白的肽适配体和DNA核酸适配体共价偶联物，药物分子阿霉素通过非共价键与DNA分子相互作用，该药物偶联物具有肿瘤靶向性和细胞增敏剂的效果。该生物分子药物偶联体，能抑制HSP70蛋白的功能，从而增强耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，另一方面阻断HSP70介导的免疫抑制作用，达到杀灭肿瘤细胞的效果。此外，通过构建荧光探针修饰的HSP70肽适配体，运用分子成像技术，在动物肿瘤模型中，实现对靶向体系发挥治疗过程的非侵入实时监测。本研究为DNA核酸适配体和肽适配体的偶联开创了先例，所构建的化疗增敏体系在动物体内具有很好的疗效。本研究成果标注SCI论文两篇，中文综述一篇，发明专利一项，待发表论文3篇。