基因修饰的内皮祖细胞靶向治疗HER-2阳性肿瘤的实验研究

内皮祖细胞(EPC)是血管内皮细胞的前体细胞，参与肿瘤血管形成。由于骨髓来源的EPC具有定向归巢到肿瘤生长部位的特点，因此被视为一种理想的肿瘤基因靶向治疗载体。申请者在前期研究中以小鼠成纤维细胞NIH3T3为细胞载体，通过基因修饰，使其合成分泌型促凋亡融合蛋白，靶向诱导HER-2阳性肿瘤细胞凋亡，取得显著的治疗效果。为进一步增强治疗的靶向性，提高杀伤效率，本课题拟构建以重组自杀基因和凋亡诱导基因修饰的EPC为核心的肿瘤双靶向治疗模式：分离培养骨髓来源的EPC，通过基因修饰，使EPC合成并分泌可靶向结合并杀死HER-2阳性肿瘤细胞的融合蛋白(第二靶向)；回输基因修饰后的EPC到荷瘤动物体内，利用EPC固有的肿瘤趋化性（第一靶向）使其在肿瘤生长部位或转移灶产生持续杀伤效应。该治疗策略对于具有特定膜标记分子的肿瘤具有高度的靶向性，可能为肿瘤的基因治疗提供一条高效、持续、低毒的新途径。

人表皮生长因子受体2（HER-2）是目前公认的肿瘤细胞表面标志物之一，它是癌基因erbB-2/neu的表达产物， 正常细胞表面几乎不存在HER-2 ，而腺癌细胞膜往往出现HER-2过表达，如胃癌、卵巢癌和乳腺癌。本研究将重构型caspase-6基因分别与erbB-2单链抗体基因（e23sFv）、PE转膜结构域（PEⅡ）或白喉毒素 （Diphtheria tox in, DT）的Furin识别位点的编码序列 （FDT）结合，成功构建重组真核表达载体pCMV-e23sFv-PEII-RC6 及pCMV-e23sFv-FDT- RC6，该重组质粒表达的融合蛋白具有以下特点：（1）e23sFv为HER2的单链抗体，可以靶向结合HER2表达阳性肿瘤细胞；（2）PEⅡ或FDT结构域使融合蛋白具有内吞体转位活性，可以有效释放到靶细胞胞浆中；（3）大小亚基颠倒的重构型caspase-6具有诱导细胞凋亡活性。将pCMV-e23sFv-PEII-RC6 及pCMV-e23sFv-FDT-RC6分别转染小鼠成纤维细胞NIH3T3，获得稳定转染的细胞系PEⅡ-RC6-3T3和FDT-RC6-3T3，体外实验结果显示PEⅡ-RC6-3T3和FDT-RC6-3T3可有效合成并分泌融合蛋白e23sFv-PEII-RC6和e23sFv-FDT- RC6，该融合蛋白可靶向进入HER2阳性肿瘤细胞SGC7901，并显著诱导细胞凋亡，96小时诱导凋亡细胞比例可达70%以上；动物实验结果显示，PEⅡ-RC6-3T3和FDT-RC6-3T3接种后可有效抑制裸鼠HER2阳性移植瘤的增长，并显著延长荷瘤裸鼠的存活时间，免疫组化结果证实，caspase6在瘤体细胞内高表达，大量肿瘤细胞发生凋亡反应。本研究结果充分证明了以细胞作为基因治疗载体，移植后治疗具有显著标志物肿瘤的可行性和有效性，为HER2阳性肿瘤的靶向治疗提供了一种新的策略和方法。