不同脂肪酸对中华绒螯蟹脂肪酸结合蛋白FABP表达调控的研究

The type and distribution of Fatty acid binding protein (FABP) is closely related to the ligand binding affinity, the fatty acids needs of the organization and the function it involved in. Previous studies have indicated that less crustaceans FABPs types were found but they participate in a variety of physiological processes. While at present, their distribution, ligand affinity and function were poorly studied. Based on our prelimilary study,we will search and clone more types of FABP in Eriocheir sinensis, a steady-state fluorescence intensity measurement and a steady-state fluorescence measurement will be used to detect the ligand binding affinity of FABPs with different fatty acids and other hydrophobic ligand.These FABPs will be located in hepatopancreas,testis,blood cells and other tissues by in situ hybridization and immunofluorescence location. To study the regulatory function of different fatty acids, a different fatty acid content/ratio feed will be fed to the crab, and further study on single fatty acids on the role of Es-FABP9、10 will be carried out in vitro culture conditions.Through the above analysis, the relationship between ligand affinity, tissue distribution, fatty acid metabolism-related genes and the FABPs will be clarified under different fatty acids conditions,which may facilitate the research on differentiation and function of FABPs in crustaceans species.

脂肪酸结合蛋白FABP的种类和分布与其结合的脂肪酸、组织的脂肪酸需求及其参与的功能有着密切关系，研究表明甲壳动物FABP的种类分化较少但参与多种生理过程，而目前对其分布、配基亲和力及功能的研究甚少。本项目在现有结果基础上，在中华绒螯蟹中寻找更多的FABP类型，利用稳态荧光光谱及稳态荧光各向异性对中华绒螯蟹FABP与脂肪酸等疏水配基的亲和力进行全面的分析，采用原位杂交、免疫荧光等手段了解FABP在肝胰腺、精巢、血细胞等组织细胞中核酸、蛋白水平上的分布和其参与的功能。采用不同脂肪酸组成及含量饲料进行活体养殖实验研究脂肪酸对FABP的调控作用，并进一步在离体培养条件下研究单一脂肪酸对Es-FABP9、10的调控作用。通过以上研究阐明中华绒螯蟹FABP与脂肪酸亲和力、组织分布、脂肪酸代谢相关基因在不同脂肪酸调控下的相互作用关系，同时为甲壳动物FABP分化与功能研究的深入提供基础资料。

课题围绕脂肪酸对中华绒螯蟹三种FABP的表达调控展开研究，首先在原来Es-FABP9、10基础上，又找到了Es-FABP3，后续的研究对三种FABP进行了基因组结构的比较，并在中华绒螯蟹13种组织中表达差异分析。利用不同脂肪酸与ANS在三种FABP脂肪酸结合位点的竞争性结合，分析了Es-FABP3、9、10与棕榈酸(PA)、油酸(OA)、亚油酸(LA)、DHA和EPA五种脂肪酸的的亲和力差异。结果显示Es-FABP3、9对长链不饱和脂肪酸如EPA、DHA的亲和力高于Es-FABP10，而Es-FABP10对棕榈酸(PA)、油酸(OA)等短链饱和脂肪酸的亲和力较高。通过不同脂肪酸比例的饲料对中华绒螯蟹的投喂，初步明确了不同脂肪酸对Es-FABP3、9、10以及中华绒螯蟹肝胰腺中其他脂质代谢相关基因如Es-FAE、Es-FAD6bb、Es-FAD9表达的影响。在肝胰腺组织离体培养条件下，进一步明确不同的脂肪酸对中华绒螯蟹肝胰腺Es-FABP3、9、10表达的调控作用。在对中华绒螯蟹进行免疫刺激后，发现在血淋巴中三种Es-FABP的表达都能被外源细菌所诱导，揭示Es-FABP3、9、10均参与了免疫相关的调控。特别是Es-FABP3表现出灵敏且稳定的上调表达，且显示有明显的抑菌作用。进一步对Es-FABP3的敲降实验中发现一些抗菌肽的表达也有所下降，结合Es-FABP3对抗菌肽相关基因表达的影响，以及Es-FABP3在亚细胞定位上对细胞内dorsal蛋白分布的影响，推测Es-FABP3可以通过Toll信号通路调节抗菌肽的表达来抑制外源病菌的增殖。