剑麻斑马纹病抗病基因的挖掘与功能分析

The sisal zebra disease, caused by fungal pathogen Phytophthora nicotianae Breda is one of the main diseases in sisal, which has seriously affects the development of sisal industry. The pathogenic mechanism is not clear up to now. Preliminary results indicated that Nanya No1, screening out from backcross progeny of H.11648, have very high resistance to sisal zebra disease. In this research, transcriptome sequencing and expression analysis will be used to excavate disease resistance genes related to sisal zebra disease in Nanya No1 and H.11648, Race technique will be used to obtain the cDNA full-length of disease resistance gene, The fluorescent quantitative RT-PCR method will be used to detect the change of expression levels of disease resistance genes after inoculation of pathogen, salicylic acid and methyl jasmonate in different inoculation time. Then, function of disease resistance genes will be clarified by evaluation the disease index of transgenic H.11648 to Phytophthora nicotianae Breda.

斑马纹病是剑麻的主要病害之一，严重影响了剑麻产业的发展。目前关于斑马纹病的致病机制尚不清楚。在前期的研究中，从主栽品种H.11648回交子代中筛选到了抗斑马纹病杂种南亚1号，由于该杂种生命周期短，年产叶片数少，无法推广。本研究拟通过对斑马纹病高感品种H.11648和高抗品种南亚1号病原菌处理前和处理后的材料分别进行转录组测序和表达谱分析，通过比较两者转录本及其表达水平的差异，筛选南亚1号抗病相关基因。利用RACE的方法克隆抗病相关基因，利用定量PCR的方法检测基因对病原菌、水杨酸、茉莉酸甲酯等信号分子的响应效果及不同处理时间的表达变化情况。最后转化H.11648，通过评价转基因H.11648对斑马纹病的感病指数进一步分析基因的功能。

斑马纹病是剑麻的主要病害之一，严重影响了剑麻产业的发展。目前关于斑马纹病的致病机制和抗病机理尚不清楚。为了探讨剑麻斑马纹病的抗病机理，筛选剑麻中斑马纹病抗病基因用于剑麻遗传改良，本研究通过对热麻１号、H.11648和烟草疫霉不同接种时间进行转录组测序，分别获得83.690（H.11648）和70.110个Unigene。表达谱分析分别筛选H.11648和热麻1号中受烟草疫霉诱导表达基因分别为13,400和13,187个，烟草疫霉本身差异表达基因分别为10,581和1,792个。筛选了2个剑麻在不同逆境胁迫稳定表达的内参基因EF1α和GAPDH,克隆了2个剑麻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因AhPGIP1和AhPGIP2，2个β-1,3-葡聚糖酶基因，其中AhPGIP1受ABA诱导表达下调，低温胁迫表达量不变，受烟草疫霉、伤、NaCl胁迫、MeJA和SA诱导表达上调。AhPGIP2受ABA、低温、烟草疫霉、伤、NaCl胁迫、MeJA和SA诱导表达上调。2个β-1,3-葡聚糖酶基因分别受烟草疫霉、伤、低温和MeJA诱导表达上调，受ABA、NaCl胁迫和SA诱导表达下调。通过瞬时表达烟草发现AhPGIP1和AhPGIP2定位在细胞壁上，剑麻和烟草分别瞬时表达AhPGIP1和AhPGIP2后，可提高剑麻和烟草对烟草疫霉的抗性。通过构建含有AhPGIP1和AhPGIP2的植物表达载体，转化剑麻H.11648，目前已获得部分抗卡那霉素和Basta的剑麻转化植株。通过接种后病斑扩展情况、电镜观察H.11648和热麻1号叶片细胞超微结构变化以及重要防御酶（CAT、POD、PAL、 PPO、APX和SOD）活性分析发现，热麻1号APX,PPO活性显著比H.11648高，SOD活性显著比H.11648低，CAT, PAL和POD活性无明显差异。H.11648在接种24h，叶片开始褪绿，可见大量休止孢，叶绿体结构被破坏，植物组织开始降解，随着时间延长，可见附着孢出现，吸器形成，植物组织解体更严重，接种72h，可见大量菌丝，病斑进一步扩大。而热麻1号在接种24h可见大量休止孢和附着孢，叶绿体结构破坏，植物组织开始解体，接种48h，可见大量菌丝，接种72h，细胞壁完全解体，孢子囊空泡化，病斑变褐凹陷但未进一步扩展，未见吸器形成。本研究为从细胞学和转录组学水平探讨剑麻斑马纹病抗病机制提供了理论依据