地衣芽孢杆菌应对碳饥饿的调控机制

Bacillus licheniformis has important industrial values because it is the main workhorse for production of enzyme and antibiotics. It is able to activate regulators to modulate expression of genes in metabolism and development pathways, when it could not obtain sufficient nutritions such as carbon resources. σB and Spo0A are two master transcription factors. σB regulates reversible adaptive responses during vegetative growth; while SpoA0 is in charge of the decision-making process of sporulation. Locations of the above two transcription factors in regulatory network as well as their mutual interactions are yet clear. In addition, the mechanism of multiple putative proteins in the σB operon is a problem to be solved urgently. This project intends to use chromatin immunoprecipitation, proteomics, transcriptomics and gene knock-out technologies to discuss the regulatory mechanism of carbon-starving Bacillus licheniformis, on the basis of previous studies, including: (1) study of the interactions of σB and Spo0A under carbon starvation; (2) systematic analysis of gene differential expression under carbon starvation; and (3) discussion of the mechanism of putative proteins in the σB operon. The results of this project would reinforce the knowledge of Bacillus transcription regulatory systems, and provide information and evidence for genetic modification of the expression host of Bacillus licheniformis.

地衣芽孢杆菌是多种工业酶制剂和抗生素的主要来源。该菌的两个主转录因子是σB和Spo0A，σB是调控营养生长型细胞发生可逆适应性响应的关键调控蛋白，而Spo0A对芽孢形成的决策机制起着关键作用。它们在地衣芽孢杆菌调控网络中的定位及相互作用方式仍未明了。另一方面，地衣芽孢杆菌σB操纵子中多个推测调控蛋白的作用机制如何也是亟需解决的科学问题。本项目在前期研究基础上，拟利用免疫共沉淀，蛋白组学分析，转录组学分析，基因敲除等技术探讨地衣芽孢杆菌应对碳饥饿的调控机制。具体包括(1) 研究碳饥饿胁迫下σB与Spo0A的相互作用机制; (2) 碳饥饿条件下基因差异表达的系统分析; (3) 探讨地衣芽孢杆菌σB操纵子中推测调控蛋白的作用机制。研究结果将巩固人们对于芽孢杆菌转录调控系统的认识，同时为地衣芽孢杆菌表达宿主改造提供信息和实验证据。

地衣芽孢杆菌是一类具有重要价值的工业微生物，其应用优势的重要体现之一就是在营养匮乏条件下极强的抗逆能力，而这一能力主要源于其严密的全局调控机制。本项目针对目前对地衣芽孢杆菌碳饥饿条件下的全局调控机制认识有限，而导致菌株理性改造缺乏依据及发酵过程精确控制难以实现的问题，通过研究碳饥饿压力时主效应调控因子σB和Spo0A的调控机制和碳饥饿条件下关键基因的表达差异理清相关调控网络。为了研究特定的受调控靶基因时排除其他全局调控因素的干扰，又开发了基于木糖操纵子的可控表达系统。首先分别建立了基于CRISPR/Cas9的单基因（小片段）基因编辑系统及基于FLP/FRT的地衣芽孢杆菌基因簇（大片段）重组系统。利用所构建的基因编辑系统分别实现了调控因子σB与Spo0A基因的插入失活。所选取的细胞生理不同层面代表性的基因在野生型，调控因子基因敲除型和调控因子基因表达型菌株中的表达差异结果显示，在碳饥饿条件下，σB在细胞内的积聚可将secY和Hag基因的表达强度分别提高8.3和3.4倍；表明通过调控因子σB可加强细胞的运动以及水解酶系的分泌以提升生存能力。而在5%NaCl胁迫条件下，BL-pWB-sigB细胞内脯氨酸合成途径的关键基因proJ的转录强度提升了23倍，其同工酶proB的转录强度无变化。揭示了在重要渗透压调节剂-脯氨酸的合成途径中，proJ的表达为σB依赖型，proB为σB非依赖型。Spo0A表达细胞内的sigE和sigF表达强度均显著提升（分别为17倍和13倍），表明Spo0A通过激活一系列转录因子的表达启动芽孢形成过程。选取地衣芽孢杆菌内源木糖操纵子构建可控表达系统，通过报告基因的手段研究了该途径中第一个基因-木糖异构酶编码基因的启动子的转录效率受葡萄糖等碳源浓度的影响。结果显示葡萄糖施加的阻遏最强烈，果糖次之。进一步的，通过对启动子区域全局调控因子CcpA识别核苷酸序列的替换改变了阻遏程度，揭示了CcpA识别序列的特征。研究结果巩固了人们对于芽孢杆菌转录调控系统的认识，同时为地衣芽孢杆菌表达宿主改造提供信息和实验证据。