人参皂苷Rb1和Rg3调控神经内肽酶基因表达机制的研究

阿尔茨海默病(AD)是老年人群痴呆的最重要类型，严重影响老年人的健康和生活质量。目前普遍认为β-淀粉样肽(Aβ)沉积是导致AD发生发展的关键因素。Aβ沉积与其生成和降解失衡有关。Aβ降解异常所引起的Aβ沉积在AD发生发展中发挥了重要的作用，而神经内肽酶（NEP）则是Aβ降解代谢的关键酶。中药在治疗AD方面具有很高的研究开发价值。研究显示，人参皂苷Rb1 和Rg3能显著提高细胞的NEP活性，明显降低细胞外Aβ浓度，能够在转录水平上促进NEP基因的表达。本课题拟研究Rb1和Rg3影响NEP基因表达所涉及的启动子调控序列、转录因子和信号转导分子以及它们之间的相互作用，以便阐明Rb1及Rg3是如何在转录水平调控NEP基因表达的。这将有助于我们进一步揭示AD的发病机制及更深入地分析Rb1和Rg3的作用原理，进而将有助于我们寻找和建立新的更有效的治疗AD的药物和方法。

背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人群痴呆的最重要类型。β-淀粉样肽（β-amyloid peptide，Aβ）沉积是导致AD发生发展的关键因素。神经内肽酶（neprilysin，NEP）是Aβ降解代谢的关键酶。人参皂苷Rb1和Rg3能够在转录水平上促进NEP基因的表达。目的：构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒，探查NEP基因启动子中与Rb1和Rg3影响NEP启动子活性有关的位点及相关的转录因子。方法：用NEP基因5'上游启动区2.4 kb片段构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4。用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4 kb DNA插入片段5'端进行缺失，构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒。用Rb1和Rg3处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，检测双荧光素酶活性，观察Rb1和Rg3对NEP启动子活性的影响，并用RT–PCR和Western Blot观察Rb1和Rg3对相应转录因子表达的影响。结果：NEP基因5'上游2.4 kb DNA片段有较强的启动子活性，Rb1和Rg3能明显增加其活性。NEP基因2.4 kb DNA片段有2个正调控区（Region I和Region IV）和2个负调控区（Region II和Region III），Rb1 和Rg3分别通过Region IV和II发挥调控作用。Rb1调控NEP启动子活性可能与转录因子CP2、 Sp1和HSF1相关的信号通路有关。Rg3调控NEP启动子活性可能与转录因子CEBPβ和HSF1相关的信号通路有关。意义 初步阐明了Rb1及Rg3在转录水平调控NEP基因表达的机制，为进一步揭示AD的发病机制及更好地利用Rb1和Rg3治疗AD打下了良好的基础。