层粘连蛋白α通过Wnt/β-catenin信号通路调控成纤维细胞增殖影响膝关节内瘢痕粘连的研究

Fibroblast excessive proliferation and external matrix deposition are important factors for the formation of intraarticular scar adhesion in the knee, but the definite mechanism is not yet fully clear. Laminin is one of the important extracellular matrix components, whereas abnormal activation of Wnt/β-catenin signaling pathway leads to the proliferation of fibroblasts and excessive fiber hyperplasia. Previous studies have shown that the expression of laminin α in scar fibroblasts significantly increased; up-regulation of laminin α could promote Wnt and β-catenin expression. In this study, we will aim to: (1) culture human fibroblasts in two-dimensional environment in vitro and explore the effect and mechanism of laminin α on regulating cell proliferation through the Wnt signaling pathway; (2) prepare the three-dimensional culture medium of decellularized extracellular matrix in vitro, and explore the effect and mechanism of laminin α on regulating proliferation of fibroblasts in three-dimensional environment through the Wnt signaling pathway; (3) establish the intraarticular scar adhesion model of knee joint in rabbit, and explore the effect and mechanism of laminin α on regulating fibroblasts proliferation and affecting the adhesion formation of knee. In this study, three-dimensional culture microenvironment is used to mimic the real internal state to explore the effect and mechanism of laminin α on regulating fibroblasts proliferation, which can clarify the formation of intraarticular adhesion of the knee and provide new clues and intervention targets for the prevention and treatment of scar adhesion.

成纤维细胞过度增殖和外基质沉积是膝关节内瘢痕粘连形成的重要因素，但具体的形成机制尚未完全明确。层粘连蛋白是一个重要的细胞外基质成分，而Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可引起成纤维细胞增殖和纤维过度增生。前期研究发现瘢痕成纤维细胞中层粘连蛋白α表达明显升高；上调层粘连蛋白α能够促进Wnt和β-catenin表达。本研究拟进行：1、体外二维环境中培养人成纤维细胞，探讨层粘连蛋白α通过Wnt信号通路调控细胞增殖的作用和机制；2、体外制备脱细胞外基质三维培养基，探讨层粘连蛋白α在三维环境中通过Wnt信号通路调控人成纤维细胞增殖的作用和机制；3、建立兔膝关节内瘢痕粘连模型，探讨层粘连蛋白α调控成纤维细胞增殖、影响兔膝关节粘连的作用和机制。本研究使用三维培养微环境模拟体内的真实状态探讨层粘连蛋白α调控成纤维细胞增殖的机制，可阐明膝关节内粘连的形成机制，为瘢痕粘连的防治提供新线索和干预靶标。

研究背景和目的：成纤维细胞过度增殖和外基质沉积是膝关节内瘢痕粘连形成的重要因素。层粘连蛋白（laminin, LN）是细胞外基质的主要成分之一，是由α、β和γ三条链组成的异源三聚体糖蛋白。其中α链的LG结构域与细胞表面受体结合，调节细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为。本研究探讨体外二维（2D）培养环境中laminin α （LAMA）调控成纤维细胞增殖等生物学行为的作用和机制；LAMA在脱细胞外基质（dECM）三维（3D）培养环境中调控成纤维细胞增殖等生物学行为的作用和机制；LAMA调控成纤维细胞增殖与膝关节内瘢痕粘连程度的关系。.实验方法：构建兔膝关节瘢痕粘连模型，术后不同时间点检测瘢痕组织中LAMA的表达水平。在2D环境中培养人成纤维细胞，构建LAMA过表达和敲低/敲除的慢病毒载体分别转染人成纤维细胞，采用CCK-8、Western blot、EdU和细胞周期分析检测慢病毒转染后成纤维细胞的增殖能力；利用Transwell、划痕实验和Western blot检测细胞的迁移能力；采用流式凋亡分析和Western blot检测成纤维细胞的凋亡变化。建立脱细胞外基质（dECM）3D培养环境，鉴定并评价dECM的结构和功能后，评估LAMA在dECM培养环境中对成纤维细胞增殖的影响。.实验结果：LAMA表达量与膝关节瘢痕粘连程度呈正相关：随着瘢痕粘连程度增加，LAMA4、LAMA3和LAMA5的表达量也逐渐增加。体外2D培养环境下，LAMA4促进成纤维细胞增殖、迁移，抑制成纤维细胞凋亡，是通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路来实现的；LAMA1、LAMA3促进成纤维细胞增殖。与2D培养环境相比，dECM的3D培养环境更有利于细胞的快速粘附和增殖，而LAMA5在3D培养环境中能促进成纤维细胞增殖。.实验结论：层粘连蛋白α表达量与膝关节瘢痕粘连程度呈正相关；体外2D环境下，LAMA促进成纤维细胞增殖、迁移，抑制成纤维细胞凋亡，是通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路来实现的，提示LAMA影响膝关节瘢痕粘连的形成。dECM的3D培养环境更有利于细胞的快速粘附和增殖，LAMA5在3D培养环境中能促进成纤维细胞增殖。