从TGF-β/Smad信号转导通路探讨双重动脉血供技术对肝脏再生影响的分子机理

Previous studies have reported successful applications of dual arterial blood supply（DABS） technique in clinical settings. Our previous study also discovered that partial liver resection combining with DABS technique can keep similar liver regeneration ability, and even improve the liver regeneration at the earlier period in comparison with partial liver resection. However, the mechanisms of the changes in liver regeneration influenced by DABS technique is not clear. Based on recent research findings,this study will develop DABS model in Lewis rats using TGF-β/Smad signal transduction as study subjects. Hepatic cells were scattered by two-step perfusion, then isolated and purified by a density gradient centrifugation in Percoll. At the tissue level and cellular level, functional gene chip technique will be applied to screen target gene associating with TGF-β/Smad signal transduction pathway.Further, fluorescence quantitative RT-PCR and western-blot assays will be employed to detect the expression of signal transduction relevant cytokines. This study will benefit to clarifing the molecular mechanisms of liver generation caused by DABS technique, and establishing a good theoretical foundation for the clinical application of DABS.

双重动脉血供技术已有临床成功应用的报道。我们前期研究发现，双重动脉血供技术结合部分肝切除与单纯部分肝切除相比，具有相似的再生能力，甚至早期能够促进肝再生，然而双重动脉血供技术对肝再生影响的机制尚不清晰。为此，本项目在综合前期研究成果的基础上，以TGF-β/Smad信号转导通路为研究切入点，建立Lewis大鼠双重动脉血供模型，门静脉两步灌流法分散肝脏细胞，用Percoll密度梯度离心方法分离不同模型组肝脏的肝细胞。运用GEArray基因芯片技术，分别从组织水平和细胞水平，筛选与TGF-β/Smad通路相关的有变化意义的靶基因；进一步采用荧光定量RT-PCR技术、Western blot技术检测信号转导通路mRNA和蛋白表达水平和模式，阐明双重动脉血供技术影响肝再生的分子机理，为该技术的临床应用奠定理论基础。

肝脏正常由门静脉和肝固有动脉供应来维持肝功能和肝再生，门静脉在某些特殊情况下（如门静脉血栓形成）无法提供足够的血供时，门静脉完全由动脉血替代灌注肝脏，我们把这种情况称之为肝脏双重动脉血供（liver dual arterial blood supply, LDABS）, 其目的是保证肝脏充足血供，维持肝脏正常组织结构及功能，促进肝再生。LDABS在临床中已成功应用于处理原位肝移植前后门静脉血栓形成以及辅助性肝移植等特殊情况。然而，LDABS调控肝再生的分子机理尚不清楚。. 本研究首先建立大鼠LDABS模型，观察LDABS对肝再生的调控作用，后利用全基因组表达谱芯片和信号通路PCR芯片筛选可能参与LDABS调控肝再生的信号通路和关键基因，探究LDABS调控肝再生的信号通路机制。实验将雄性SD大鼠分两组，LDABS结合部分肝切除（partial hepatectomy, PH）组（实验组）和单纯PH组（对照组），观察肝脏大体形态及显微结构改变、检测肝功能、计算肝再生比率、EdU法检测肝细胞增殖、TUNEL法检测肝细胞凋亡，后利用全基因组表达谱芯片筛选实验组相对于对照组在不同时间点表达有明显差异的基因，并利用MAPK信号通路PCR芯片验证关键基因。. 结果表明：1. 肝再生指标检测：肝脏大体形态及显微结构、肝功能、肝再生比率、肝细胞增殖、肝细胞凋亡：对照组和实验组两组无明显差异（P＞0.05）；2. 调控肝再生的信号通路检测：实验组相对于对照组在术后不同时间点差异表达基因均显著富集的的信号通路有12条，其中 MAPK signaling pathway，NF-kappa B signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway等三条信号通路可能参与了LDABS调控肝再生的过程；3. 调控肝再生的关键基因检测：MAPK signaling pathway 中KRAS和Ubc两个基因在不同时间点均是关键基因。实验结果为研究LDABS调控肝再生的分子机理提供依据，同时为其在临床中的应用奠定坚实的理论基础。. 后续课题组利用LDABS技术成功制备一种新的大鼠辅助性部分异位肝移植模型，为研究LDABS重建大鼠辅助性部分异位肝移植移植肝血流的可行性及其调控肝再生的机理提供前期实验基础。