双重动脉血供对大鼠再生肝细胞线粒体能量代谢的影响及其机制

Mitochondrion is a key organelle for the energy metabolism in all eukaryotic cells and directly takes part in a variety of cellular pathological and physiological activities. Tremendous studies indicate that mitochondrion plays an important role in proliferation and apoptosis of hepatocytes. Our pilot study using double arterial blood supply (DABS) animal models, found that DABS can promote regeneration of liver. We hypothesize that DABS induced liver regeneration is the results of DABS increased oxygen supply and energy metabolisms. This study focuses on exploring the role of mitochondrion in DABS-relevant liver regeneration.In this study, Lewis rats are used to made DABS models. Liver mitochondrion is isolated using differential centrifugation methods. Isolated hepatocyte mitochondrion is analyzed at the following points: quantity, morphological structure change, key enzymes activities, and the generation of mitochondrion active oxygen. Furthermore, changes of mitochondrion-mediated apoptosis pathway and upstream cell signal transduction are also detected.This study will systematically uncover potential mechanisms of DABS induced liver regeneration mediated by mitochondrion metabolism changes. Also, this study will provide a theoretical basis for DABS’s clinical application and will supplement present liver regeneration theory.

线粒体是所有真核生物能量代谢场所，直接参与了多种细胞病理生理活动。大量研究证实线粒体在肝细胞增殖与凋亡过程中发挥重要作用。我们前期研究表明，在动物模型中肝双重动脉血供(DABS)能够促进肝再生，但其具体机制不清楚。我们推测可能与其增加氧供、提高能量代谢有关。为证实这一假设，本项目拟以肝脏线粒体能量代谢为研究核心，建立Lewis大鼠双重动脉血供模型，采用差速离心法分离肝脏线粒体，观察肝细胞的线粒体数量、形态结构和功能变化，测定线粒体活性氧产生，运用RT-PCR、Western blot等技术检测线粒体能量代谢关键酶、凋亡途径及其上游的细胞信号传导通路蛋白，采用亚细胞水平和组织水平相结合的方式，系统深入地揭示DABS对大鼠再生肝细胞线粒体能量代谢的影响及其潜在机制，进而阐明其促进肝再生的机理。本研究结果将为DABS技术的临床应用提供理论基础；同时，本项目亦可以新的角度丰富肝再生理论。

门静脉动脉化技术涵盖多种术式，为便于区分，课题组将门静脉血完全由动脉血替代灌注称之为肝脏双重动脉血供（LDABS）,在一些特殊情况如急性肝功能衰竭、原位肝移植以及辅助肝移植前后的门静脉血栓形成等情况取得良好效果，但临床应用也存在一些争议,这些争议的解决有赖于适宜动物模型的建立,以及在此基础上相关机制的探索。. 动物模型通过限制门静脉血流、改进门腔吻合方法、加强围术期护理等措施，模型成功率高，能够完全再现LDABS病理生理解剖特点，其研究结果能够真实反映临床并为临床提供指导。研究发现，LDABS 结合 PH 组（简称LDABS组）和单纯 PH 组相比，能够促进肝再生并长期保持肝脏形态结构。通过全基因组表达谱芯片和信号通路PCR芯片筛选参与LDABS调控肝再生的信号通路和关键基因，研究结果显示，MAPK signaling pathway，NF-kappa B signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway等三条信号通路参与了LDABS调控肝再生的过程；其中MAPK signaling pathway 中KRAS和Ubc两个基因在不同时间点均是关键基因。. 在此基础上，课题组分离肝脏线粒体，免疫组化染色标记线粒体, 与对照组、PH组相比，LDABS组影响线粒体数量。进一步探讨LDABS对肝脏线粒体能量代谢的影响，研究发现，LDABS组与PH组在在线粒体呼吸链酶Ⅰ有显著差异，在膜电位、线粒体呼吸链酶Ⅱ、Ⅲ及腺苷酸酶代谢含量活性差异不显著，提示LDABS通过线粒体呼吸链酶Ⅰ在肝再生中发挥重要作用。酶标仪检测SOD、GSH-Px以及MDA含量；Western blot检测PINK1、Bcl2蛋白表达。与对照组相比，LDABS组与PH组在SOD含量、GSH-Px含量方面均减少，MDA含量表达差异不显著，LDABS组的Bcl-2蛋白表达水平明显高于对照组，PINK1蛋白表达差异不显著，提示氧化应激参与LDABS对肝脏再生的影响，LDABS能够抑制凋亡。iTRAQ差异蛋白质组学质谱定量技术(isobaric Tagging for Relative and Absolute Quantitation)检测各组线粒体蛋白表达，发现诸多蛋白表达不同，不同蛋白功能正在深入研究中。