microRNAs-22经PTEN/Akt信号通路对心肌肥厚的调控

心肌肥厚是慢性心衰最重要的病理改变之一，其发生机制尚未阐明。已有研究发现，多种microRNAs在肥厚心肌中表达异常。我们前期实验发现：miR-22在大鼠心肌细胞肥厚模型中表达显著增高，同时过表达的miR-22增加心肌细胞表面积和心房利钠肽的编码基因Nppa表达。提示miR-22可能在心肌肥厚的进程中发挥重要作用。研究显示，心肌细胞中高表达的PTEN在心肌肥厚中起着非常关键的作用，而在肿瘤细胞中已经证实miR-22是PTEN/Akt通路的一个重要调节因子。本实验拟通过RT-PCR、Northern Blot、Western Blot、双荧光报告基因、腺病毒介导的基因过表达等方法，在细胞和动物模型水平明确miR-22通过抑制PTEN参与到心肌肥厚的发生过程，并进一步在肥厚大鼠模型上采取心室多点注射过表达腺病毒载体的方法，在体水平观察miR-22的作用。为整体干预心肌肥厚的进程提供新的靶点。

项目执行期间，我们利用PE或AngII成功建立了大鼠心肌细胞肥大模型，并在此基础上发现肥大的心肌细胞中几种miRNA的表达发生明显改变。其中miR-22的表达明显上调。为了进一步研究miR-22在心肌肥厚发生中的具体作用，我们通过miR-22mimic或miR-22inhibitor来分别实现心肌细胞内miR-22的过表达和敲低。结果发现miR-22过表达后心肌细胞体积明显增大，心肌肥厚分子标志物nppa明显升高，myh6表达下降。相反敲低miR-22能抑制PE或AngII诱导的心肌细胞肥大。为了进一步挖掘miR-22调节心肌肥厚的具体机制，我们应用荧光素酶检测和western blot来确定miR-22的靶基因，结果发现miR-22过表达能够显著抑制含有PTEN3’UTR区域的报告载体的荧光素酶活性。同时心肌细胞中过表达miR-22能显著地减少PTEN的蛋白水平，而敲低miR-22则能提高心肌细胞中PTEN的水平。证明PTEN是心肌细胞内miR-22的靶基因。为了进一步验证miR-22在心肌肥厚中的调节作用，我们构建了miR-22心肌特异转基因斑马鱼，通过基因型鉴定和定量PCR确定miR-22心肌特异斑马鱼构建成功，同时对转基因斑马鱼心脏进行肥厚和心功能的评估，结果发现miR-22心肌特异转基因斑马鱼心肌中心肌肥厚分子标志物表达明显升高，反应心功能指标的心率也明显增高，说明miR-22过表达导致心肌发生肥厚并损害心功能。. 同时我们也通过Tg(fli1:EGFP)斑马鱼胚胎中显微注射不同浓度的morpholino来敲低miR-22表达水平，结果发现敲低miR-22对斑马鱼胚胎血管新生有明显的抑制作用，证明miR-22参与调节斑马鱼的血管新生。. 此外，我们还发现miR-22能够促进饥饿诱导的心肌细胞自噬，而miR-22的这种调控作用是通过p38α靶基因完成的。