癫痫大鼠海马线粒体分裂、融合及其调控机制的研究

线粒体是一种高度动态的细胞器，线粒体不断地进行着生物合成、分裂和融合以及自噬等，并在细胞凋亡中发挥核心作用。线粒体分裂和融合与线粒体形态和功能密切相关，并与线粒体生物合成、自噬和凋亡相互作用，共同维持细胞的存活和功能。我们已经初步研究证实癫痫发作中存在线粒体损伤、线粒体生物合成功能下降和自噬应激反应以及神经元凋亡，在此基础上我们拟通过癫痫在体动物模型和离体模型，采用荧光显微镜、电镜、激光共聚焦显微镜、免疫组织化学、免疫印迹、膜片钳技术、实时定量PCR和其他分子生物学等技术，进一步探讨癫痫发作神经元损伤中线粒体分裂、融合的变化特点，并通过应用转染和基因干扰技术、化学抑制剂研究线粒体动态变化在神经元损伤和凋亡中的作用和可能的发生机制，进一步阐明癫痫发作的病理生理机制，为癫痫的理论研究提供新的思路，并为癫痫药物治疗的开发提供新的方向，具有重大的理论和实际意义。

1、.选择成年男性Wistar大鼠，腹腔注射氯化锂-匹罗卡品制作癫痫动物模型，并给与线粒体分裂抑制剂mdivi-1预处理，观察癫痫发作氧化应激反应及线粒体分裂和融合相关蛋白的表达，以及mdivi-1的神经保护作用。结果发现：线粒体分裂蛋白Drp1、hFis1以及氧化应激产物 氧化应激标记物8-羟基脱氧鸟苷(8-oHdG)在癫痫持续状态后4 h时开始升高，24 h达高峰，72 h仍处于较高水平；线粒体融合蛋白Mfn1、Opa1在癫痫持续状态后4 h时出现短暂的升高，随即表达下降，并于24 h时达最低水平。癫痫持续状态后24 h时，大鼠海马CA3区Drp1阳性神经元数目显著高于对照组，Opa1阳性神经元数目显著低于对照组。给与 mdivi-1预处理抑制线粒体分裂可部分抑制8-oHdG的升高，减轻癫痫发作神经元凋亡，提示mdivi-1对癫痫大鼠具有神经保护作用。.2、.选择成年男性Wistar大鼠，腹腔注射匹罗卡品制作癫痫动物模型，并给与抗坏血酸预处理，观察癫痫发作氧化应激反应及线粒体自噬的表达，以及抗坏血酸的神经保护作用。结果发现：癫痫发作可激活自噬和氧化应激反应，自噬蛋白beclin 1以及氧化应激产物 丙二醛MDA在癫痫持续状态后24 h时显著升高，SOD则明显降低。癫痫持续状态后24 h时，大鼠海马CA3区存活神经元数目显著低于对照组。给与抗坏血酸预处理后可部分抑制自噬激活，降低beclin1的表达，降低大鼠致痫率和提高癫痫大鼠的24h存活率，研究提示抗坏血酸对癫大鼠具有神经保护作用。.3、.采用无镁细胞外液处理培养的海马神经元诱导的自发性癫痫细胞模型，观察PARP抑制剂的神经保护作用。结果发现：癫痫放电可激活PARP；给与PARP抑制剂DPQ可抑制AKT的磷酸化和AIF的线粒体核移位从而可显著减少癫痫放电导致的神经元凋亡。研究提示DPQ可能具有抗癫痫作用。