过表达线粒体融合蛋白2调控线粒体融合分裂平衡和Ras信号通路对早期糖尿病肾病的保护作用机制

Diabetic nephropathy (DN), the leading cause for end stage renal disease, lacks effective intervention in its early stage. Proliferation and hypertrophy of mesangial cells, as well as excessive matrix synthesis, closely associated with Ras signaling pathway and mitochondria, are the major changes in early DN. Mitofusin-2 (Mfn2), with the structure domain to promote mitochondrial fusion and Ras binding, might participate in the development and progression of DN. We found in our previous studies that overexpression of Mfn2 maintained the quantity balance of mesangial cells through inhibition of high-glucose-stimulated cells proliferation and increase of apoptosis. In addition, downregulation of Mfn2 was identified in DN kidney tissue; while overexpression of Mfn2 reduced collagen synthesis and improved pathological changes. Nonetheless, how Mfn2 plays such a protective role in the early stage of DN remains unknown. Based on our previous findings, in the current study, we plan to construct the mesangial cells and SD rats models of Mfn2 overexpression (wild-type, loss of fusion function and loss of biding function) and Mfn-2 gene inhibition by transfection in vitro and in vivo. Then, the cells will be stimulated by high glucose and the rats treated with streptozotocin. The localization of Mfn2, regulations of Mfn2 on mitochondrial fusion-fission balance and Ras protein, influences of Mfn2 on signaling pathways and molecular markers related with proliferation, hypertrophy, apoptosis and matrix synthesis will be tested and evaluated at different time points. We aim to investigate the role of Mfn2 and its mechanisms in the early stage of DN and to identify new target for the treatment and prevention of the disease.

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病的主因，缺乏早期有效干预。肾小球系膜细胞（GMC）增殖肥大和基质生成过多是DN早期主要病变，与Ras信号通路和线粒体密切相关。线粒体融合蛋白2(Mfn2)具有促线粒体融合和绑定Ras蛋白的结构域，可能参与病变。我们前期研究发现：过表达Mfn2可抑制高糖刺激的GMC增殖并诱导凋亡；DN肾脏存在Mfn2下调，过表达 Mfn2可减少胶原合成，改善病变。然而其早期保护作用机制未明。本课题在前期研究基础上，采用体内外转染方法，构建过表达Mfn2(野生型、融合功能缺失、Ras绑定功能缺失)及基因抑制的GMC、SD大鼠。用高糖刺激细胞和STZ诱导动物模型，在不同时间点检测Mfn2定位，深入研究Mfn2对线粒体融合分裂平衡和Ras蛋白的作用，及对信号通路的影响，并检测增殖肥大、凋亡、基质生成指标。从不同水平探讨Mfn2在早期DN中的保护作用机制，为DN防治提供新靶点。

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)严重威胁人类健康，其分子发病机制未明，及早进行有效干预是亟待解决的重要课题。本项目针对线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2, Mfn2）在DN中的分子作用机制进行了深入研究，基本完成既定研究内容，并且产生有超越计划书的研究成果。本研究通过体内体外实验证实了 Mfn2这一重要蛋白在细胞内的分布，与线粒体和 RAS 信号蛋白的相互作用。 我们成功构建完成用于过表达的Rat线粒体融合蛋白2的功能域缺陷基因，在体内体外获得稳定转染，证实了过表达的 Mfn2分别通过线粒体保护和 Ras 途径改善细胞凋亡，减少细胞外基质分泌，从而缓解糖尿病肾病进展。我们的数据显示在糖尿病肾病模型中，过表达 Ras绑定区缺陷的Mfn2可以挽救AGE导致的线粒体形态和功能改变，并影响ECM主要成分胶原 IV 的合成。这种现象的机制是过表达的 Mfn2 影响了胶原 IV 的启动子近端区域转录因子绑定点的组蛋白 H3K27Ac乙酰化。通过对 Mfn2基因启动子上下游的分析，结合ChIP技术获得了 Mfn2的 Enhancers 信息，为进一步研究 Mfn2在糖尿病肾病中的基因表达调节机制打下基础。我们的数据也提示，过表达跨膜区缺陷的Mfn2可以使高糖刺激的细胞 Ras 磷酸化受到抑制，证明 Mfn2对细胞的保护作用之一是通过抑制 Ras-ERK1/2信号通路进行。转染 Mfn2通过影响Ras 系统，部分异常增殖凋亡效应可以逆转。本研究项目在研究领域和技术方面均进行了创新，在国际上具有领先性。由于本项目结果已建立基础，对于进一步开发Mfn2在DN中的靶向治疗药物具有良好的研究前景。本研究已发表5篇国际期刊SCI论文（已标注基金），其中两项研究成果还分别在2016年欧洲肾脏病年会(EDTA)和2015年美国糖尿病年会(ADA)进行交流。