多酚氧化酶基因的体外高效表达及催化儿茶素形成茶黄素机理的研究

多酚氧化酶是儿茶素氧化合成茶黄素的关键酶。茶黄素是红茶中的重要品质成分，具有多种保健功效与药理功能。红茶中茶黄素的含量低，以红茶为原料来开发制备茶黄素的价值不大。而以茶儿茶素为底物，利用生物技术进行体外生物合成茶黄素，具有重要的理论与实际意义。本项目拟筛选出能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因，并克隆其全长基因；构建基因工程菌，使目的基因在酵母菌内高效表达，通过正交回归组合设计优化工程菌高效生产多酚氧化酶的培养条件；优选出合成茶黄素的最佳条件；采用蛋白质层析系统和快速蛋白质纯化液相色谱分离纯化多酚氧化酶同工酶，利用数学模型结合电子自旋共振等方法研究多酚氧化酶同工酶与儿茶素组分相对应的催化氧化关系, 揭示多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理。

本研究以丰水梨嫩叶为材料，提取基因组DNA，应用PCR的方法克隆得到丰水梨PPO基因，基因全长1782 bp，没有内含子，编码的PPO属于亲水性蛋白质，无跨膜结构，含有593个氨基酸，分子量约为65.8 KDa，理论等电点为8.4。PPO的N端含有一段由47个氨基酸组成的转运肽，而无信号肽，引导PPO定位于叶绿体内。去除转运肽的成熟PPO分子量为60.8 KDa，理论等电点为6.69。应用NCBI数据库中的在线BLAST功能对丰水梨PPO基因比对，结果显示丰水梨PPO基因的核苷酸序列及其编码的对应氨基酸序列与日本砂梨的相似性均为为99%。去除该部分转运肽序列后，克隆得到去除转运肽的成熟PPO基因，其核苷酸列和氨基酸序列与日本砂梨的核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均达到99%以上。PPO中含有两个铜离子结合区，主要位于PPO二级结构中的α-螺旋区域中。.分别将克隆得到的前体PPO基因和成熟PPO基因克隆至原核表达载体(pET32a)，构建了重组原核表达载体。将重组原核表达载体转化至表达菌株DE3感受态细胞，经IPTG诱导表达得到目的蛋白。不同温度条件进行原核诱导表达，目的蛋白在28℃条件下表达较好；积累量在诱导培养3-6 h内较多，随着诱导时间的延长，蛋白积累量增加不明显，PPO活性研究发现，PPO活性为50U/(mL.min)；体外氧化儿茶素实验表明，诱导蛋白能够氧化儿茶素生成茶黄素，前体PPO和成熟PPO催化儿茶素合成茶黄素含量分别为1.37mg/g和1.74mg/g。.分别将克隆得到的前体PPO基因和成熟PPO基因克隆至真核表达载体(pPICZα-A)，构建了重组真核表达载体。真核表达重组菌株GS115经甲醇诱导表达，用分光光度计法测定上清酶液中PPO活性，最高可达30.0U/(mL.min)。体外氧化儿茶素实验表明，诱导蛋白能够氧化儿茶素生成茶黄素，前体PPO和成熟PPO催化儿茶素合成茶黄素含量分别为0.94mg/g和1.03mg/g。.单宁酶水解酯型茶黄素的效果最佳，其反应最佳条件为：反应体系的温度为40℃、pH值为5.0、酶浓度为2.4mg/mL，最佳反应时间120min。水解后TF的含量高达199.836mg/g。用制备型反相高效液相色谱对茶黄素提取物进行了制备分离，得到4个茶黄素单体化合物，并经IR、MS、NMR等表征。