干细胞在温敏性支架内三维动态培养与收获

采用多组分共聚合、接枝及蛋白修饰等技术，制备各种含PNIPAAm的温敏支架或大孔微载体，实现干细胞三维培养且非酶解收获干细胞。研究NIPAAm含量、反应时间、温度等对温敏支架分子间及分子内氢键、进而亲疏水性和溶胀性的影响；扫描电镜及显微CT成像观测支架的结构与形貌；体积相变化法检测支架的溶胀/皱缩性质;环境扫描电镜检测37℃及20℃两种温度下支架孔道和孔隙率的变化。采用灌注、旋转壁或转瓶生物反应器分别对圆柱支架和大孔载体内的骨髓间充质干细胞进行三维动态培养，研究细胞接种密度、灌注速率或反应器转速对温敏支架中干细胞生长曲线的影响，建立支架中干细胞生长动力学、流动与传质的数学模型，确定最大灌注速率或反应器转速及支架中可培养细胞的最大密度。研究降温收获细胞时灌注速率或反应器转速对细胞脱离支架的启动作用。本研究可为深入理解三维温敏材料与细胞间的相互作用、发展新的干细胞培养及非酶解收获体系做出贡献。

项目的背景.干细胞数量有限，不经扩增很难满足临床需求。采用胰酶收获细胞会损伤膜蛋白，因此需要研发更好的干细胞培养与收获方式。温敏性聚N-异丙基丙烯酰胺PNIPAAm能有效保护细胞膜蛋白和相关受体，从而维护干细胞功能。将温敏材料与干细胞体外培养相结合，有望形成新型干细胞培养系统。.主要研究内容.采用多组分共聚合、接枝及蛋白修饰等技术，制备各种含PNIPAAm的温敏支架材料，研究NIPAAm含量、反应时间、温度等对温敏支架分子间及分子内氢键、进而亲疏水性和溶胀性的影响；检测不同温度下支架的结构与形貌以及溶胀/皱缩和润湿性的变化。采用灌注、旋转壁或转瓶生物反应器对支架内的间充质干细胞进行三维动态培养，研究细胞接种密度、灌注速率或反应器转速对温敏支架中干细胞生长曲线的影响，确定最大灌注速率或反应器转速及支架中可培养细胞的最大密度。研究降温收获细胞时剪切力对细胞脱离支架的启动作用。研究温敏降温非酶解收获方法在保持干细胞特性方面的优势。.重要结果.1）合成了一种新型的以PNIPAAm为主体的温敏材料及共聚物膜，其表面润湿性、表面分子结构和温敏层厚度均可调节，从而具备温敏性、可控性、可逆性和稳定性。2）骨髓及脂肪来源的间充质干细胞在温敏膜上培养并降温脱附收获后，细胞具有更好的活性，更强的增殖能力，更高的多向分化能力以及更多的蛋白质残留，各项指标均优于传统胰酶消化法。3）成功制备了温敏性中空纤维膜，当温度变化时其表面接触角、蛋白粘附量均发生了显著变化，原因在于PNIPAAm链的疏水缔合作用，使其结构由舒展状态变化为蜷缩状态所致。4) 温敏性中空纤维膜上培养的成骨细胞活性、增殖状况、细胞的ALP活性及骨钙素蛋白的表达等与对照组相比均无明显差异，显示接枝PNIPAAm的温敏性中空纤维膜具有良好的生物相容性。5）成功制备了不同比例的PVDF-g-PNIPAAm温敏性共聚物及其薄膜材料，骨髓间充质干细胞能够在其上粘附生长并降温脱附。6）成骨细胞和间充质干细胞在上述各种温敏材料上多代培养及收获后，细胞活性、成骨性能、干细胞特性保持等各方面均优于经酶解多次消化收获的细胞。.关键数据及其科学意义.所制备的各种温敏材料均能成功应用于干细胞培养和非酶解收获中，能有效维持干细胞特性，为干细胞体外培养提供了新思路和新技术。将温敏材料与适宜生物反应器技术相结合，可以构建新的体外大规模扩增干细胞的培养体系。