低温联合载温敏神经干细胞的纤维蛋白支架治疗重型颅脑创伤

Microenvironment is the pivotal point for the stem cells to repair the neurological function of traumatic brain injury (TBI). The reconstruction of neural circuits is the ultimate goal of stem cells transplantation for TBI. In our previous study, we adopt the combinational therapy of temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells and the mild hypothermia to treat severe TBI in rats. We found that the combinational therapy improved the grafted microenvironment after TBI and enhanced the survival rate of grafted stem cells in some extent. However, the neuroanl differentiation rate is too rare to reconstruct the neural circuits. In this study, we try to built the temperature neural stem cells (tsNSCs) by the transfection of tsSV40LT and produce the fibrin scaffold suitable for brain tissue. Under the mild hypothermia therapy, we attempt to implant the tsNSCs, multiple neurotrophic factors, and fibrin solution into the injury site of TBI in SD rats. We evaluated the neuromotor function and examined cognitive function by Morris water maze. After that, we observed the survial and migration of stem cells in vivo by MRI. At last, we examined that survial, migration, differentiation, axonal outgrowth and extension, formation of synapse and the release of neurotrasmitter by immunofluorescence and immune electron microscopy. We would like to integrate a comprehensive measures on the basis of the consort of fibrin scaffold for brain tissue, nutritional support of neurotrophic factors, and differentiation characteristics of neural stem cells. We wish that this study could provide some theoretical basis for further investigation and clinial translation of combinational therapy with temperature stem cells and mild hypothermia.

微环境是影响干细胞修复颅脑创伤(TBI)的关键因素，神经环路重建是干细胞治疗TBI的最终目标。在前期实验中，课题组构建了温敏脐带间充质干细胞，与亚低温联合治疗大鼠重型TBI，在一定程度上改善了移植微环境和提高了干细胞存活率，不足的是，神经元的分化比率很低，难以达到重建神经环路的目标。本课题拟以改良前期研究为出发点，通过转染tsSV40LT构建温敏神经干细胞，以携带复合因子的纤维蛋白支架为载体，植入亚低温治疗下的TBI大鼠损伤部位。行为学评估神经运动功能和认知功能的修复；活体SPIO-MRI观察移植干细胞的存活和迁移；离体eGFP示踪，观察干细胞的存活、分化、突触形成、神经递质释放等。本课题拟在探讨纤维蛋白支架适宜脑组织工程的基础上，借助携带因子的营养支持和神经干细胞的分化特征，进一步改善微环境和重建部分神经环路，为温敏干细胞与亚低温联合方式的深入研究和临床转化提供一定的理论基础。

急性期原位移植不仅可在损伤灶形成干细胞的有效聚集，还能及时挽救损伤变性的神经细胞，可最大限度地修复颅脑创伤（TBI）后的神经功能。然而，TBI后缺血缺氧的“毒性”环境不利于干细胞的存活、增殖和分化。研究证实，亚低温治疗可通过多种机制改善TBI后的微环境，但33℃的亚低温环境不适于普通干细胞的生长。温度敏感型干细胞，因其在33℃增殖活性最强而37℃则由增殖转为分化的特征，可能是TBI急性期联合亚低温移植的理想干细胞选择。本研究原代分离、培养和鉴定了神经干细胞（NSCs）；通过感染携带温度敏感型猿猴病毒40 大T 抗原（tsSV40LT）基因的病毒，以建立温度敏感型神经干细胞（tsNSCs）系，并评估和探讨了tsNSCs的温度可控性和温敏的潜在原理；配制了纤维蛋白支架，并观察了其微观结构，检测凝固时间、降解速度和生物相容性；采用液压冲击建立了大鼠重型TBI 模型，移植tsNSCs纤维蛋白支架，同时实施亚低温治疗；评估移植前后TBI 的神经运动功能和认知功能的恢复情况。结果发现，本研究成功分离培养了NSCs，其表达nestin蛋白，并且具有向神经元和胶质细胞分化的潜能。经RT-PCR和Western blotting鉴定，tsNSCs构建成功；我们观察到tsNSCs具有温度敏感特征，其原理可能与P53与SV40LT的大量结合有关。经扫描电镜检测，纤维蛋白支架结构均匀，孔隙适中；支架的凝固时间控制在10分钟左右，生物相容性好。mNSS评分和Morris水迷宫结果显示，亚低温联合tsNSCs移植可显著改善TBI后的神经运动功能和认知功能。.本研究的持续时间为1年；在这一年里，我们按照原计划进行了研究。本研究基于组织工程学理论，借助TBI 适宜亚低温治疗这一结论，联合tsSV40LT介导的永生化NSCs 系的温度可控性特征，巧妙地构建了一套综合治疗TBI 的措施，可解决当前干细胞移植面临的细胞数量不足、低存活率等一系列的问题，同时通过微环境的进一步改善和神经环路的部分重建，可为TBI 的神经功能修复研究提供一定的理论基础。本项目共发表SCI收录论著1篇、国内核心期刊论文5篇；待发表SCI论著1篇、国内期刊论著1篇（均已撰写完毕），部分实验数据尚在整理和撰写中；研究成果获批武警部队科技进步二等奖；培养硕士生2名；组织和参加多次国内外学术会议。