奶牛乳腺脂类合成代谢转录调控机制与基因网络构建

Based on recent work of other researchers related with fat fat synthesis and metabolism, this program will use transcriptomic sequencing, microRNA sequencing, yeast two-hybrid system and other high throughput technology and bioinformatics methods to explore the regulatory mechanism of fat metabolism of several main processes in the mammary tissues during a complete lactation period, including FA importing into cells, de novo synthesis, Xenobiotic and Cholesterol transport, Acetate and FA activation and intra-cellular transport, Fatty acid synthesis and desaturation, Fatty acid synthesis and desaturation and Lipid droplet formation and secretion. The relationship between synthesis and metabolistic regulation of fats and immunity of mammary was also explored at the level of transcription. The research would pave a good foundation for elucidating the regulation of fat synthesis and metabolistic regulation, and even the components of cow milk to produce high quality raw milk.

本项目旨在前人研究基础上，以中国荷斯坦奶牛为研究对象，利用转录组测序、microRNA测序、酵母双杂交试验等高通量技术和生物信息学方法，研究乳腺组织在一个完整泌乳期（从妊娠后期至泌乳结束）内，其分泌细胞从血液中获取脂肪（FA import into cells）、脂肪酸从头合成（de novo synthesis）、外源固醇转运、脂肪酸激活及胞内运送、脂肪酸细胞内合成和去饱和（Fatty acid synthesis and desaturation）至脂滴形成和分泌（Lipid droplet formation and secretion）等代谢过程的转录及转录后调控机制，并在转录水平上探索脂肪生成、代谢调控和乳腺免疫调控的相互关系，为厘清奶牛乳腺细胞脂肪合成、代谢机制，实现乳成份的定向调控选种，生产优质原料奶奠定实验基础。

奶牛泌乳是一个动态过程，本研究在跟踪测定中国荷斯坦奶牛一个完整泌乳周期中乳成分、乳脂肪酸水平的基础上，在泌乳的特定6个时间段采集乳腺组织，运用转录组测序和生物信息学分析技术筛选差异表达基因，获得与乳脂代谢相关的基因，结合脂肪酸变化趋势和规律探索与脂肪酸代谢相关基因的表达模式，旨在进一步发掘泌乳周期中乳脂相关基因及其调控机制。选择体况相近、分娩时间接近（±3d）的2胎奶牛3头，微创采集分娩前7d及泌乳30、90、180、270、315d乳腺组织，液氮保存，用于提取RNA，进行转录组分析。本研究根据NCBI中的牛SIRT2基因序列，在其保守区设计特异性引物，以中国荷斯坦奶牛脂肪组织为cDNA模板克隆SIRT2 基因；对克隆得到的基因进行序列分析；以GAPDH 基因为内参基因分析SIRT2 在中国荷斯坦奶牛的心脏、肝脏、肾脏、肺、胃、结肠、肌肉、脂肪等8个组织的表达水平；构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293-A细胞系中表达，观察融合蛋白的亚细胞定位；使用预测软件预测了泌乳差异表达的miRNA中三个靶向调控SIRT2基因的miRNA：miR-212、miR-375和miR-655，以乳腺上皮细胞系（mac-T）及人肾上皮细胞系（293T）为模型，通过荧光定量PCR技术、双荧光素酶报告基因技术等筛选出一个靶向SIRT2基因的miRNA；通过过表达和抑制表达miRNA-212后测得脂肪相关基因SREBF1、SCD、FAS、LPL及PPARG的相关表达量并且通过EDU和油红O染色实验证明miRNA靶向SIRT2基因对乳腺上皮细胞系中脂肪生成的影响。研究使用荧光素酶报告和Western Blot试验对表达差异显著的miR-106b 和ABCA1调控关系进行验证。miR-106b与关键的miR-106b靶标（ABCA1）一起提供潜在的miRNA-mRNA调节对；在奶牛乳腺上皮细胞过表达miR-106b可以抑制乳脂代谢，而抑制miR-106b可以促进乳脂代谢。通过甘油三酯、胆固醇等实验证明ABCA1在乳腺上皮细胞中促进乳脂代谢。通过补救试验验证了miR-106b通过ABCA1调控乳脂代谢。本研究构建了miR-106b- ABCA1调控网络图，揭示miR-106b- ABCA1途径调控牛奶乳脂代谢的分子机理，为提高牛奶品质提供理论依据。