lncRNA-BMNCR/miR-145/FSCN1途径调控奶牛金葡菌型乳腺炎自体保护的分子机制

Understanding the molecular mechanism of cow mastitis will be helpful for prevention and treatment of mastitis. Our previous study has identified a novel long non-coding BMNCR which differentially expressed in Streptococcus aureus-induced mastitis. Bioinformatics analyses revealed that there are two miR-145 binding sites on BMNCR sequence. However, it is still unclear that what is the exact function of BMNCR, and if BMNCR can act as a competitive endogenous RNA to regulate FSCN1 expression by sponging miR-145 in cow mastitis. Therefore, in the present study, we will reveal the function of BMNCR and miR-145 in immune response and autoprotection through RNAi, western blot and CRISPR/Cas9 tests. Furthermore, by conducting dual luciferase reporter system, RIP and RNA Pull down experiments, we will clarify the regulatory relationship between BMNCR/miR-145/FSCN1 and demonstrate the molecular mechanism of the BMNCR/miR-145/FSCN1 signal transduction network regulating cow mastitis and immune response. These efforts will provide an important reference for further prevention and treatment of mastitis and the development of targeted drugs in dairy cows.

研究奶牛乳腺炎发生发展过程中自体保护的分子机制对于乳腺炎防控具有重要意义。申请人前期鉴定到一个在奶牛金葡菌型乳腺炎中上调表达的长链非编码RNA-BMNCR，生物信息学分析显示BMNCR上存在两个miR-145结合位点。但BMNCR在奶牛乳腺炎发生发展过程中行使什么功能？能否通过竞争性结合miR-145，调控miR-145靶基因FSCN1，参与机体免疫应答尚不清楚。因此，本项目拟通过RNAi、western blot和CRISPR/Cas9等试验，阐明BMNCR和miR-145在免疫应答、自体保护中的功能；利用双荧光素酶报告系统、RIP、RNA Pull-down等技术，揭示BMNCR/miR-145/FSCN1间的调控关系，解析BMNCR/miR-145/FSCN1信号转导网络在奶牛乳腺炎发生发展过程中，参与自体保护、诱导免疫应答的分子机制，为后续防控奶牛乳腺炎、开发靶向药物提供重要参考。

乳腺炎是奶牛最常见、造成损失最严重的疾病之一,而金黄色葡萄球菌是引起乳房炎最常见的一种病原菌。从分子遗传学的角度，本研究通过研究miR-145/ FSCN1轴和miR-145/CBFB轴探讨了lncRNA BMNCR在奶牛金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎中的炎症反应和自我保护机制。通过金黄色葡萄球菌感染中国荷斯坦奶牛乳腺组织，成功构建人工诱导的乳腺炎模型。对比金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎组织与正常乳腺组织，RNAseq共筛选出283个上调lncRNA和346个下调lncRNA，进一步研究18个差异调节显著的lncRNA，成功证实了一种新的特异性高表达lncRNA CUFF.43696.1，并更名为BMNCR，5’和3’RACE分析证实BMNCR的全长为5964个核苷酸。在牛乳腺上皮细胞(BMECs)中，亚细胞定位结果表明BMNCR主要定位在细胞质中。进行功能丧失实验，通过qRT-PCR、westernblot、流式细胞术和EdU染色检测细胞因子、增殖和凋亡的变化。结果表明，BMNCR显著增加细胞凋亡，并抑制细胞增殖。敲除BMNCR后，IL-1α、IL-2、IL-6、IL-8和IL-12的分泌增加。生物信息学分析表明，BMNCR可以靶向8个miRNA，qRT-PCR、westernblot、荧光素酶报告和多重验证技术深入分析表明BMNCR靶向miR-145，BMNCR可以负调控miR-145的表达。过表达和抑制miR-145以研究miR-145在BMECs中的功能。结果表明，BMECs中 miR-145 的过表达显著降低了 IL-12 和 TNF-α 的分泌，但增加了 IFN-γ 的分泌，BMECs的增殖也受到抑制；miR-145的抑制显著降低了IL-1α和IL-2的的分泌，但BMECs没有出现明显的凋亡。使用TargetScan构建miR-145和23个潜在mRNA靶相互作用网络的图谱，FSCN1和CBFB是miR-145的靶基因之一，这一点通过qRT-PCR、westernblot、荧光素酶报告和多重验证技术得到了进一步证实。本研究揭示了BMNCR-miR-145-FSCN1和BMNCR-miR-145-CBFB在金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎中的分子调控机理，为开发奶牛乳腺炎靶向药物和开展抗性选育奠定实验基础。