奶牛两种菌型乳房炎易感性多座位基因型的筛选和验证的研究

The recent researches of our research group revealed the important role of IL8 and its receptor CXCR1 in the immune regulatory pathway against mastitis in dairy cow. SNP screen and multi-loci combination statistic analysis indicated the highest MSE value occurred in the genotype AG/TA/KA at three mutation sites. Based on these results, this research will conduct a series of experiments and analyses including S. agalactiae and S. aureus challenge test in mammary gland, gene chip hybridization, signaling pathway analysis and LC-ESI-MS/MS, to screen main immune signal and related molecular markers.The study will also screen for SNPs in the main exons and regulatory region and conduct multi-loci combination statistic analysis using Multi-loci Reducing Dimensionality and Daviation model aiming to screen for S. agalactiae and S.aureus susceptible gene combination and multi-loci genotypes with cellular and in vivo verification. The findings would pave a sound foundation for clarifying the mechanism of immunoregulation and multi-loci marker-assisted selection against S.aureus causing mastitis in dairy cow.

课题组既有研究发现IL8及其受体CXCR1在奶牛乳房炎免疫调控信号通道中扮演重要角色，SNP扫描和多座位聚合统计分析表明以上两基因3个变异位点的多座位基因型AG/TA/KA具最高的MSE值。在此基础上，本研究1、通过奶牛乳房内S. agalactiae和S. aureus攻毒试验、芯片杂交、信号通路分析和差异蛋白质液相色谱-电喷雾串联质谱联用分析，筛查奶牛乳房炎主要免疫信息通道和易感性相关分子标记、候选基因；2、对信号通路上主要基因外显子和调控序列进行群体SNP扫描，并进行群体遗传学分析；3、通过构建多座位降维离差分析模型，进行多座位聚合分析，筛选出奶牛两种菌型乳房炎易感性多基因组合和易感性多座位基因型；4、对筛选出的多座位基因型进行细胞学和活体验证。该研究为研明奶牛乳房炎免疫调控机制和奶牛乳房炎易感性多座位标记辅助选择奠定基础。

乳房炎是奶牛最常见、造成损失最严重的疾病之一,而金黄色葡萄球菌和链球菌是引起乳房炎最常见的二种病原菌。目前有关金黄色葡萄球菌和链球菌引起奶牛乳房炎的遗传机制并不太清楚。本研究在利用链球菌和金黄色葡萄球菌人为诱导奶牛乳房炎基础上，利用基因表达谱芯片和iTRAQ技术分析了2种病原菌引起奶牛乳房炎乳腺组织基因组水平和蛋白质表达水平的差异，同时结合测序、飞行质谱等方法，对筛选的主要差异基因进行了SNP扫描和基因分型，利用多因素方差分析法、Logstic分析等方法分析了SNP多态与乳房炎抗性及泌乳性状等的关系。并利用多座位降维离差分析模型，筛选出奶牛两种菌型乳房炎抗性相关多基因组合和多座位基因型，并在细胞学和活体上验证。结果表明：成功地建立了奶牛临床型乳房炎疾病模型。金黄色葡萄球菌组与空白对照组相比，共筛选出显著差异表达基因3271个，上调2057个，下调1214个；链球菌组共发现136个差异表达基因，其中58个表达下调，78个表达上调。生物信息学分析表明，金黄色葡萄球菌乳腺炎主要涉及造血细胞谱系、细胞因子，细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路等信息通路，而链球菌性乳腺炎主要涉及补体及凝血级联反应、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、JAK-STAT、MAPK等信号通路。在蛋白质层次上，共发现168个差异蛋白，其中66个在金葡菌组表达上调，102个表达下调，主要涉及20条与防御、免疫和炎症相关的通路。CXCR１、IL8、LF、IL12R等差异基因共发现30个SNP位点，关联分析发现CXCR1-642、CXCR1-980、IL8-2988、LF基因 -190 A>G、-156A>G和-131 C>T 共6个位点对SCS有显著影响，CXCR1-816 A>C和LF-(-190) A>G位点对奶牛乳房炎抗性有显著影响。多座位降维离差分析表明，CXCR1-816 AA基因型和LF-(-190) AA型组合乳房炎抗性最强，患临床乳房炎次数最少，同时也具较长的生产寿命和较高淘汰胎次。该分子标记组合可以有效地针对奶牛生产寿命和临床乳房炎抗性对种牛进行辅助选择，为研明奶牛乳房炎免疫调控机制和实施奶牛乳房炎易感性多座位标记辅助选择奠定了基础。