马钱子总碱囊泡凝胶散结消肿的分子机制研究

Interleukin-1（IL-1）and tumor necrosis factor-α（TNF-α） are considered to be of great importance in the proliferation of the synovium and pannus. Total alkali of Nux Vomica, a bioactive components encapsulated by niosome, was found to inhibit inflammatory reactions of synovium in arthritis by its lente liberantes and targeted therapy. Autophagy perhaps regulates cytokines -mediated synovium proliferation and angiogenesis in experimental arthritis. Rapamycin，3-MA or siRNA will be used to modulate autophagic pathways. Cytokines-mediated synovium proliferation and angiogenesis in experimental arthritis will be observed. Effects of niosome encapsulated total alkali of Nux Vomica on activation of I PI3K/Akt/TOR and III PI3K/Beclin1 pathways will be evaluated. Its effects on the pathogenesis of RA including proliferation of synovium and pannus will be compared with microdialysis and miRNA Chips.

IL-1、TNF-α等炎性细胞因子，持续刺激滑膜细胞增殖，引起类风湿关节炎（RA）滑膜增生和血管翳形成。新型给药系统马钱子总碱囊泡凝胶具有透皮、缓释的靶向治疗优势,可有效治疗免疫性关节炎滑膜炎。自噬是一种新的细胞死亡形式，可能介导炎性细胞因子引起的滑膜增生和血管新生（Angiogenesis）。本课题分别采用工具药Rapamycin，3-MA或小干扰RNA等，阻断或激活自噬通路，观察其对炎性介质IL-1和TNF-α刺激下免疫性关节炎滑膜分泌、增殖和血管翳形成的影响；同时选择前期研究证明可有效抑制RA滑膜自噬基因表达的马钱子总碱囊泡凝胶，观察其对免疫性关节炎滑膜I型PI3K/Akt/TOR和III型 PI3K/Beclin1通路活化、滑膜细胞分泌、增殖和血管翳形成的影响，并结合关节腔微透析和miRNA 芯片高通量筛选，分析阐明新型中药靶向制剂通络止痛、散结消肿的分子机制。

目的：探求两种不同的自噬通路对佐剂性关节炎（AA）滑膜细胞分泌、增殖和血管翳形成的影响。阐明新型制剂马钱子碱囊泡凝胶散结消肿的分子靶向机制。.方法：SD 大鼠随机分为正常组、AA 模型组、马钱子碱囊泡凝胶高、中、低剂量( 25， 12. 5， 6. 25 mg·kg－ 1 ),分别建立大鼠佐剂性关节炎和骨关节炎模型，观察免疫性关节炎滑膜增生、血管翳和炎性变化等；在microRNA芯片高通量筛选和数据挖掘基础上:（1）采用慢病毒包装PTRF Crispr技术，观察自噬相关基因PTRF对炎性因子PGE2作用下成纤维滑膜细胞增殖和侵袭的影响及马钱子碱的作用。（2）采用Orai 和Stim 蛋白调控的门控型Store-operated Ca2+ entry (SOCE) 阻断剂YM-58483和PKA阻断剂H89，观察马钱子碱对PGE2刺激下人成纤维滑膜细胞(FLS)c-AMP/PKA-SOCE通路活化的影响。（3）采用eNOs的阻断剂L-NAME和激活剂D-NAME，分别观察马钱子碱囊泡凝胶对大鼠佐剂性关节炎滑膜自噬和凋亡的影响。同时采用微透析技术观察药物在关节腔的分布。.结果:（1）在最低给药剂量（4.5mg/只）下，药物可在关节腔检出，给药后8小时达峰值。（2）马钱子碱囊泡凝 ( 25， 12. 5， 6. 25 mg·kg － 1 )可有效改善病理损伤，抑制滑膜细胞增生和软骨破坏。进一步机理研究发现马钱子碱可抑制炎性因子作用下成纤维滑膜细胞增殖和侵袭，自噬基因PTRF可调控其作用。(3) PGE2可能经由cAMP-PKA信号通路激活HFLS SOCE钙通路的活化，这可能是马钱子碱作用靶点。马钱子碱囊泡凝胶可有效降低继发侧关节滑膜组织和血清炎性介质IL-1β，IL-6，TNF-α水平；同时佐剂致炎后，存在滑膜自噬水平的升高，马钱子碱囊泡凝胶可以有效抑制AA 大鼠自噬信号通路的激活。而eNOs的抑制剂L-NAME可以阻断马钱子碱囊泡凝胶的作用，eNOs的激活剂D-NAME可以扭转这一作用，说明eNOs-AMPK-mTOR是马钱子碱囊泡凝胶的作用靶点。.结论： 透皮缓释制剂马钱子碱囊泡凝胶局部给药后可显著降低对侧关节滑膜组织中的炎性反应，eNOs-AMPK-mTOR信号通路调控的滑膜自噬可能是其作用靶点。