软骨发育中巨型囊泡装配分子机制的研究

Chondrogenesis in the developing skeleton requires transformation of chondrocytes from a simple mesenchymal condensation to cells with a highly enriched extracellular matrix (ECM). This transition is in part accomplished by up-regulation of effectors of protein transport to cope with both increased demand for transport of ECM components and the large size of molecules including procollagen. In a zebrafish mutagenesis screen to identify genes essential for cartilage development, we identified a mutant that disrupts the gene encoding Sec1 family domain containing 1 (sly1). Homozygous sly1 mutant embryos exhibit a profound craniofacial abnormality caused by a failure of chondrogenesis. Loss of sly1 was found to hinder ER to Golgi transport of ECM proteins. This preliminary data suggested SLY1 acts as central component in assembling of ECM-containing mega-carrier. In this proposal, we planned using zebrafish embryo and mammalian chondrocyte differentiation model to explore the molecular mechanisms by which sly1 involving in assembling of ECM-containing mega-carrier. We plan to address the following questions in our proposal. First, how SLY1 was recruited to ECM-enriched domain at the ER. Second, how SLY1 regulates the fusion between post-ER membrane compartment and ECM-enriched domain at the ER, which grows into an ECM-containing mega-carrier. We expect the results from this proposed study will provide evidence to the detail mechanism of ECM intracellular transferring and advance our understand for diseases such as osteogenesis imperfecta and congenital craniofacial abnormalities.

软骨细胞分化过程中大量胞外基质(ECM)的积累依赖于包括胶原蛋白在内的ECM蛋白的合成和转运，这些纤维状蛋白的长度超过300 nm，其在细胞内从内质网向高尔基体的转运需要装配专门的巨型囊泡。在软骨细胞分化中，这类负责转运大体积蛋白的巨型囊泡如何装配、如何选取和装填被运载的蛋白，是细胞生物学和发育生物学中关键但未解决的问题。在前期的工作中，我们发现SLY1（一个Sec domain蛋白）突变的斑马鱼胚胎由于软骨发生缺陷导致严重的头面部发育异常。进一步的分析表明SLY1突变的软骨细胞内，ECM蛋白无法从内质网向高尔基体转运，这些信息提示SLY1作为核心组份参与巨型囊泡的装配。我们计划利用斑马鱼胚胎和哺乳动物软骨细胞体外分化系统来探究在软骨细胞分化过程中，SLY1如何通过控制内质网－高尔基体中间囊泡与内质网之间的质膜融合来参与巨型囊泡的装配。

在骨骼发育的过程中，软骨细胞从简单的、紧密排列的间充质形态转变为被丰富的胞外基质包裹的形态，这个分化过程对于骨骼完成形态建成和获得正常生物物理功能不可或缺。在上述的软骨细胞分化过程中胶原蛋白等胞外基质蛋白的合成和分泌受到动态而精密的调控，在人类的胚胎发育和幼儿生长中，不正常的软骨细胞胞外基质分泌积累会导致胎儿头面部畸形等发育异常以及脆骨症等病症。对于软骨细胞胞外基质运输分子机制的研究工作的将有助于更好地理解这些疾病的发生过程并有助于研发新的预防和诊断手段。包括胶原蛋白在内的胞外基质在 ER 内合成后会形成刚性的杆状三螺旋前胶原蛋白纤维，这样的蛋白纤维长度超过 300nm，不能被装载进普通的直径在 60-80nm 之间的 COPII 包被转运囊泡。在细胞内存在一套专门转运这类大体积蛋白的的系统，在特异的运载蛋白受体、分子伴侣的协作下，这些大体积蛋白被主动地分选、富集并装载到专门的巨型囊泡内以启动其细胞内转运。为了寻找新发育调控基因，我们进行了一次基于Tol2转座酶的基因捕获并从中得到了一个带有SLY1功能缺失突变的斑马鱼品系。基于这个新制备的品系，我们综合利用分子生物学、实验胚胎学手段，系统性地研究了:1，SLY1在脊椎动物胚胎发育中的功能;2，SLY1缺失导致头面部发育异常的机制; 3， SLY1和TANGO1及STX18协同控制胞外基质转运的机制。通过这一系列研究，我们发现:1，SLY1缺失会导致脊椎动物头面部软骨发育缺陷；2，SLY1缺失导致细胞外基质运输分泌异常并导致软骨细胞发生内质网应激反应；3，SLY1和TANGO1及STX18协同控制2型胶原蛋白前体运转分泌。本项研究第一次通过体内实验分析了Sec1/Munc18家族基因SLY1在脊椎动物胚胎发育中的功能并初步解释了SLY1参与控制软骨细胞、肠道杯状细胞、晶状体纤维细胞终末分化的分子机制，为理解包括头面部畸形在内的多类出生缺陷提出了新的可能机理。