基于核酸适配体固定化酶微反应器的在线定量蛋白质组学分析

"Shot-gun method" has been widely applied in the proteomics research, and protein digestion is one of the key steps before identified by mass spectrometry. Developing efficient enzyme microreactors with regenerated matrix and realizing the online protein separation, enzyme digestion, and mass spectrometry detection will be of significance to promote the development of proteomics research. In this project, the high specificity and high affinity between aptamer and protein were used to prepare the immobilized enzyme microreactor based on aptamer. The study of this project was focused on the screening technique for trypsin aptamer, the preparing technique for enzyme microreactor, and the regenerating technique for immobilized matrix. Moreover, the dynamic immobilizing method was used to prepare the enzyme microreactor with regenerated matrix based on aptamer. On this basis, the analysis platform for the online quantitative proteomic with enzyme digestion, 18O labeling, separation, and quantitation was constructed, and was further used to study the differential proteomics of SH-SY5Y cell under the simulating effect of space microgravity. The use of online enzyme microreactor not only can improve the efficiency of enzyme digestion, shorten the reaction time, but also can effectively reduce or even eliminate the back labeling reaction in 18O labeling quantitation, ensure the accurate and reliable detecting results of mass spectrometry, and finally provide a new strategy to achieve the online analysis of comparative proteomic.

蛋白质组学研究中的"鸟枪法"是目前普遍采用的技术，在进行质谱鉴定之前，蛋白质酶解是必须的一个关键步骤。发展固载基质可再生的高效酶微反应器，实现在线蛋白质分离、酶解和质谱检测，对推动蛋白质组学研究的发展具有重要意义。本项目利用适配体与蛋白质之间的高特异性和高亲和性作用，发展基于核酸适配体的固定化酶微反应器。重点研究胰蛋白酶适配体筛选技术、酶微反应器制备技术以及固载基质再生技术等关键技术，采用动态固定化的方法，制备基于核酸适配体的固载基质可再生的酶微反应器。在此基础上，构建集蛋白质酶解、18O标记、分离和定量于一体的在线定量蛋白质组学分析平台，并用于研究模拟空间微重力效应下SH-SY5Y细胞差异蛋白质组学。在线酶微反应器的使用，不仅可以提高酶解效率、缩短反应时间，还可以有效减少甚至是消除18O标记定量中的回标反应，保证质谱检测结果准确可靠，为实现比较蛋白质组学的在线分析提供新的策略。

蛋白质组学研究中的“鸟枪法”是目前普遍采用的技术，在进行质谱鉴定之前，蛋白质酶解是必须的一个关键步骤。发展固载基质可再生的高效酶微反应器，实现在线蛋白质分离、酶解和质谱检测，对推动蛋白质组学研究的发展具有重要意义。本研究在建立核酸适配体筛选技术并筛选得到与胰蛋白酶和糜蛋白酶有高特异性和高亲和性核酸适配体的基础上，发展了基于核酸适配体的胰蛋白酶和糜蛋白酶固定技术，制备了固载基质可再生的酶解反应器，并与液相色谱质谱联用，进行蛋白质的定性定量分析。所取得的成果包括：（1）磁珠SELEX技术的建立：以磁珠SELEX技术为手段，建立了胰蛋白酶和糜蛋白酶的核酸适配体筛选技术，并筛选得到了与胰蛋白酶和糜蛋白酶具有高特异性和高亲和性的一组核酸适配体；（2）基于核酸适配体的酶微反应器的制备：采用戊二醛交联的方法将氨基修饰的核酸适配体固定于氨丙基硅胶颗粒上，通过核酸适配体与胰蛋白酶之间的高选择性和高特异性结合力，制备得到了基于核酸适配体的酶微反应器；（3）酶微反应器的性能评价：分别以胰蛋白酶的小分子底物或标准蛋白质为研究对象，考察酶微反应器的性能，并与传统的溶液中的酶解结果进行对比，结果表明，基于核酸适配体的酶微反应器具有较高的酶活，且稳定性也比较好，对蛋白质的酶解结果可与传统溶液中的相媲美；（4）固载基质的再生：酶微反应器活性降低后，用乙腈进行洗脱，然后用缓冲液平衡，利用核酸在极端条件下变性，而温和条件下复性的特点，进行酶的重新固载，结果表明再生后的酶微反应器表现出了较高的酶活，证实了固载基质较好的重复使用性；（5）搭建酶微反应器与HPLC/MS联用的蛋白分析鉴定平台：以标准蛋白和生物样品为研究对象，考察了联用系统的酶解性能，并与传统溶液酶解方法进行对比。结果表明，联用系统具有高的酶解效率和高度的自动化，可以替代常规溶液酶解并应用于蛋白质组的分析研究中。与此同时，设计并制备了基于PDMS材料的芯片酶微反应器，并搭建了芯片酶微反应器与HPLC/MS的在线联用平台，结果表明芯片酶微反应器对蛋白质的酶解时间大大缩短，且同样可以得到较好的蛋白分析结果；（6）基于适配体的固定化胰蛋白酶用于18O标记定量蛋白质组学研究：将基于适配体的固定化胰蛋白酶与18O标记定量蛋白质组学技术结合，用于研究环境污染物（HBCD）暴露的差异蛋白质分析，为HBCD的毒性作用机制及生物标志物的筛选提供基础数据。