表面活性蛋白-D在脓毒症诱导的小肠上皮细胞损伤中的作用及机制研究

Sepsis is the major cause of gut barrier failure, intestinal epithelial cells apoptosis play a key role in occurrence and development of gut barrier failure.Surfactant Protein (SP-D) was confirmed to inhibit sepsis-induced lung epithelial cells apoptosis. Lipopolysaccharide（LPS）is a key pathogenic factor in sepsis-induced gut barrier failure. It was proved that sepsis induced intestinal injury was increased when SP-D gene was knockout. However,the role of SP-D in gut barrier failure still need to be explored.The project aim to explore the alteration of SP-D gene knockout mice in intestinal epithelial pathologic detection,cells apoptosis,intestinal permeability,and intestinal microbiota in pneumonia-induced sepsis models; We depleted the gut microbiota in mice,then performed Cross-faecal microbiota transplantation (FMT) in the two groups, and then infected them pneumonia to explored whether the gut microbiome mediated the impact of SP-D on the intestinal epithelial cells in sepitic models. The LIVE/DEAD staining, Transepithelial resistance(TER) and molecular biology methods will be used to detect the effect of SP-D on the cell cytotoxicity,cell permeability and Bax/Bcl-2 expression of intestinal epithelial cells after stimulation by LPS;Also to prove that whether through inhibiting TLR4 mediate MYD88-TRAF6-NF-κB signal pathway that SP-D inhibit intestinal epithelial cells apoptosis.

脓毒症常致肠道屏障功能衰竭，肠上皮细胞凋亡是其核心环节。研究证实表面活性蛋白D(SP-D)能抑制脓毒症时肺上皮细胞凋亡。脂多糖(LPS)是脓毒症肠道屏障功能衰竭的关键致病因素。申请人发现SP-D基因缺失时，脓毒症致小肠损伤增加，但SP-D在肠道屏障功能衰竭中作用尚不清楚。本项目旨在通过肺炎脓毒症模型证实SP-D缺失对小肠病理改变、细胞凋亡、通透性改变及肠道菌群的影响；通过在剔除肠道菌群小鼠采用交互粪便移植方法证实肠道菌群介导了脓毒症时SP-D对小肠上皮细胞的影响；通过小肠上皮细胞的体外模型，应用LIVE/DEAD染色、跨上皮电阻测定及分子生物学检测验证重组腺病毒感染致SP-D表达改变、人重组SP-D蛋白及SP-D对LPS刺激后细胞毒性、细胞通透性及Bax/Bcl-2表达的影响；探讨SP-D是否通过抑制TLR4介导的MYD88-TRAF6-NF-κB通路活化来抑制LPS诱导小肠上皮细胞凋亡。

脓毒症是ICU最常见的致死因素，而肺部和腹腔是导致脓毒症最常见的感染部位。在严重脓毒症等重症患者各种病理状态下，肠屏障功能衰竭是引起全身性炎症反应综合征的启动因子和刺激因子，肠道被认为是多器官功能障碍综合征的“发动机”。严重脓毒症时肠道的低灌注以及炎症介质的作用，导致肠道内稳态失衡，肠上皮细胞最易受损，导致肠道屏障功能衰竭。肠道内稳态取决于肠上皮、肠道菌群以及宿主免疫系统之间复杂的相互作用的平衡]。然而，脓毒症打破了平衡，导致了肠上皮的变化（上皮细胞凋亡增加、通透性增加和屏障功能降低）和肠道菌群的变化（肠内致病性细菌增加、细菌毒力增强以及抗生素的耐药性增加），这些变化导致肠道屏障功能衰竭，进入了损伤/放大/重复Injury/Amplification/Repeat）的恶性循环，导致MODS的发生，甚至危及患者生命。因此阻断脓毒症并发的急性肠屏障功能衰竭具有十分重要的意义。我们分离并培养了原代小鼠肠上皮细胞，miR-182-5p的下调抑制了肠上皮细胞的凋亡，具有保护肠道上皮细胞的作用。同时，miR-182-5p可引起细胞凋亡增加和细胞增殖减少。此外， SP-D可与致病菌结合，清除致病菌和凋亡体，在调节免疫应答中发挥重要作用。我们的研究显示SP-D在肺炎小鼠模型中显著降低。SP-D被预测为miR-182-5p的下游目标。表明miR-182-5p通过靶向SP-D促进金黄色葡萄球菌肺炎诱导的脓毒症中的肠道损伤。在脓毒症小鼠模型中，肠道损伤被触发， MEG3在体内显著降低，miR-129-5p升高，SP-D受到抑制。MEG3过表达后，通过下调脓毒症小鼠的miR-129-5p来抑制肠道损伤。研究表明MEG3部分抑制了细胞凋亡，增强了Caco2细胞的增殖。miR-129-5p过表达可逆转体外MEG3的作用。通过过调控miR-129-5p和SP-D, MEG3可能成为脓毒症脓毒症引起的肠道损伤的潜在靶点。