表面活性蛋白-A在脓毒症诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制研究

Sepsis is the major cause of Acute Kidney Injury(AKI),Renal tubular epithelial cells apoptosis play a key role in occurrence and development of AKI.Surfactant Protein A(SP-A) was confirmed to inhibit sepsis-induced lung epithelial cells apotosis.Lipopolysaccharide（LPS） is a key pathogenic factor in sepsis-induced AKI.It was proved that renal tubular epithelial cells could express SP-A,which was increased in time and dose dependent manners induced by LPS.However,the role of SP-A in AKI still need to be explored.The project aim to explore the alteration of SP-A gene knockout mice in renal tubular pathologic detection,evans blue dye leakage and renal cells apoptosis in septic AKI models;The LIVE/DEAD staining,spectrophotometric and molecular biology methods will be used to detect the effect of SP-A and different protein fragment on the activity,smooth LPS(S-LPS) cytotoxicity and Bax expression of renal tubular epithelial cells after stimulation by S-LPS;Also to prove that whether by inhibiting TLR4 mediate TRAF2-ASK1-JNK signal pathway that SP-A inhibit renal tubular epithelial cell apoptosis.Through revealing the role and mechanism of SP-A in sepsis-induced renal tubular epithelial cell injury, the subject provides a new way to prevent AKI.

脓毒症常致急性肾损伤（AKI），肾小管上皮细胞凋亡是其核心环节。研究证实表面活性蛋白-A(SP-A)能抑制脓毒症时肺上皮细胞凋亡。脂多糖（LPS）是脓毒症AKI关键致病因素，申请人发现LPS刺激后肾小管上皮细胞表达的SP-A明显升高，但其在AKI时意义尚不清楚。本项目旨在通过脓毒症AKI模型证实SP-A基因缺失对肾小管病理改变、肾小管Evans Blue渗漏、肾脏细胞凋亡等影响；通过肾小管上皮细胞体外模型，应用LIVE/DEAD染色、光谱光度及分子生物学验证重组腺病毒感染致SP-A表达改变、SP-A蛋白及不同功能片段对S-LPS刺激后细胞活性、S-LPS细胞毒性及Bax表达影响；探讨SP-A是否通过抑制TLR4介导的TRAF2-ASK1-JNK信号通路活化抑制S-LPS诱导肾小管上皮细胞凋亡。本课题揭示SP-A 在脓毒症致肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制,为寻求防治AKI提供新的理论依据。

项目背景：脓毒症常致急性肾损伤(AKI)，肾小管上皮细胞凋亡是其核心环节。脂多糖(LPS)是脓毒症AKI关键致病因素，申请人发现LPS刺激后肾小管上皮细胞表达的SP-A明显升高，但其在AKI时意义尚不清楚。.主要研究内容：通过脓毒症AKI模型证实SP-A基因缺失对肾脏的影响；探讨SP-A是否通过抑制NF-KB的活性发挥肾脏保护作用。通过肾小管上皮细胞体外模型，分别验证SP-A蛋白及SP-A SiRNA转染对LPS刺激下NF-KB介导的炎性因子表达的影响。.重要结果：24h后，SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠BUN和Cr以及乳酸的水平显著高于野生型脓毒症小鼠。两组小鼠血PH值未见显著差异。SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠的肾脏损害较野生型更严重。SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠24h组的肾损伤评分显著高于野生型脓毒症小鼠24h组。6h和24h后，SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠肾脏EB染料浓度和湿重显著高于野生型脓毒症小鼠。其凋亡细胞数量在SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠肾脏显著多于野生型脓毒症小鼠。Bcl-2的表达显著低于野生型脓毒症小鼠，caspase-3的表达水平显著高于野生型脓毒症小鼠。SP-A/SP-D KO脓毒症小鼠肾脏NF-KB p65及p-IKB-a、IL-6和TNF-a的表达显著高于野生型脓毒症小鼠。. SP-A蛋白主要分布在HK-2细胞的细胞膜和细胞浆。l、2、5、10mg/L的LPS刺激HK-2细胞8h后，SP-A1和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较0、0.1 mg/L显著升高；同时，应用5mg/L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24 h后，SP-Al和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较LPS作用0、2 h显著升高。l、2、5、10mg/L的LPS刺激HK-2细胞8h后, TNF-a表达较0、0.1 mg/L显著升高；应用5mg/L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24h后，TNF-a表达较LPS作用0、2 h显著升高。SP-A SiRNA转染+LPS刺激组NF-KB P65表达显著低于、TNF-a表达显著高于脂多糖刺激组及空白质粒转染+脂多糖刺激组。 .科学意义：本项目旨在探讨SP-A基因及蛋白在脓毒症诱导的肾小管上皮细胞损伤时的作用及分子机制，以期发现脓毒症急性肾损伤治疗新靶点