新疆雪莲rubisco小亚基Sikrbcs2基因的抗寒机制研究

已克隆雪莲Rubisco小亚基sikrbcs2基因，能显著提高转基因烟草的抗冻性和维持较高的光化学效率。为研究它的抗寒机制，项目分别用组成型、冷诱导启动子和Sikrbcs2自身启动子调控Sikrbcs2基因在烟草中表达。通过测定转基因烟草的抗寒性和低温生长特性，分析Sikrbcs2基因在不同表达模式下的抗寒能力。通过叶绿素荧光技术和光合系统测定仪分析转基因烟草的光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qp)、非光化学猝灭(NPQ)和低温光合响应曲线，研究其低温碳同化特性，并通过叶绿素荧光参数和光合参数对比分析，研究sikrbcs2基因可能具有的低温光合保护机制。进一步通过转基因烟草杂合Rubisco含量和活性等相关生化指标测定，研究Sikrbcs2基因的提高抗寒性的生理生化基础。最后，通过转化冷敏感的番茄，研究该基因在不同植物中抗寒效果，分析其在基因工程方面的应面方面的应用前景。

核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是光合碳同化的双功能酶,它催化核酮糖-1, 5-二磷酸(RuBP)的羧化和加氧反应,并调节二者之间的比值。试验证明天山雪莲具有很强的低温光合能力和光呼吸能力。从雪莲中克隆了RubisCO的小亚基基因Sikrbcs2，与向日葵的亲缘关系较近。表达Sikrbcs2基因的转基因烟草和番茄具有较高的低温光化学效率和较强抗寒能力。克隆和分析Sikrbcs2基因的启动子，发现有光应答，低温、逆境相关等顺式作用元件。定量PCR检测发现SikrbcS2基因可受低温、渗透、盐胁迫诱导，并随温度的下降表达量增强，与雪莲生境具有一致性。光合参数分析表明：转SikrbcS2基因的烟草的净光速率对低温更敏感，但转基因的烟草在低温下的生物量显著高于对照，低温胁迫后的恢复生长能力更强。比较光呼吸参数表明：转基因烟草和番茄的光呼吸速率高于对照植株，提示SikrbcS2转基因的烟草和番茄在低温期间能够重新利用光呼吸或暗呼吸释放的CO2，以维持卡尔文循环的正常运转。利用光呼吸的抑制剂处理转基因烟草，转基因烟草的抗寒能力急剧下降，证明转SikrbcS2基因的烟草抗寒力的提高与光呼吸的增大有关。.经不同低温处理，提取转基因烟草的RubisCO，通过Western blot杂交，证明雪莲的SikrbcS2小亚基能够与烟草的大亚基形成杂合的RubisCO，进一步分析RubisCO的活性，发现SikrbcS2小亚基能够稳定和提高转基因烟草的RubisCO活性。通过叶绿体荧光、抗氧化酶及生理生化分析组成型和诱导型表达的SikrbcS2基因的烟草和番茄，发现其表达模式与叶绿素含量，类胡萝卜素，PSII最大光化学效率（Fv/Fm）、电子传递效率ETR、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脯氨酸含量存在极显著的相关性，高的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）和电子传递效率ETR与qP值、类胡萝卜素含量与NPQ、脯氨酸含量与APX存在着相对应关系，因此，转基因烟草和番茄抗寒力的提高，不仅是通过光呼吸耗散过剩电子而起到光保护的作用，而且也通过抗氧化酶系统和渗透保护物质来提高细胞的防护能力。在增加光合电子传链效率时，植物可通过调节光合机构的平衡来增加叶片叶绿素的含量，提高植物的光合能力。田间种植的转基因番茄极显著增加了产量和果实大小，展示了SikrbcS2基因良好的应用前景。