新疆雪莲△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因低温响应机制研究

冰缘植物雪莲已演化出一套适应低温变化、动态维持生物膜稳定的调控机制，成为研究低温抗性机理的理想材料。低温胁迫时植物主要通过提高不饱和脂肪酸含量和比例来提高膜的流动性。脂酰ACP脱饱和酶是脂肪酸合成中的第一个脱饱和酶，对调控植物不饱和脂肪酸含量和比例起重要作用。我们从新疆雪莲中新克隆了一个△9硬脂酰ACP脱饱和酶基因(SIKSAD)，转基因烟草能明显提高烟草的抗寒性。生物信息学分析该基因存在两个不同转运肽和核定位信号，与已报道的SAD基因不同。本项目以拟南芥基因组学为研究平台，通过在拟南芥突变体中异位表达，系统比较SIKSAD基因与拟南芥SAD基因在转录与翻译调控、组织和亚细胞定位、膜脂组成与膜生理功能的低温响应机制差异，初步确定温度响应过程中，SIKSAD基因在不饱和脂肪酸代谢网络途径中的表达调控方式及对生物膜低温稳定性和抗寒性的影响，为进一步研究雪莲细胞膜与其它抗寒基因相互作用奠定基础。

新疆雪莲△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因低温响应机制研究.利用简并引物从已建立的雪莲cDNA全长文库中克隆了天山雪莲△9硬脂酰-ACP脱饱和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD）基因，该基因全长为1555bp，编码396个氨基酸，氨基酸序列Blast比对发现它与菊科植物红花（C.tinctorius），向日葵（Helianthus annuus）的SAD基因氨基酸同源性达96% ，而核苷酸同源性分别只有86%和72%。利用GFP对该基因的信号肽进行表达定位分析，表明该基因定位叶绿体中。转sikSAD基因的酵母，不仅能够提高酵母低温存活力，并且显著提高对酒精的耐受度。转基因烟草的表达分析表明，该基因能明显提高植物的抗冻能力。通过RT-PCR半定量分析，天山雪莲的sikSAD基因随温度的降低，表达量上调，同时温脂肪酸组成变化分析表明，该基因的表达与提高膜脂的油酸含量呈显著的正相关。克隆了天山雪莲的sikSAD基因启动子946bp，生物信息学分析，与拟南芥的同源基因fab2基因的启动子只有相似性仅为25.51%，其响应元件存在很大的不同。分别利用克隆的sikSAD基因启动子和fab2基因的启动子驱动sikSAD基因表达，不同温度条件下转基因烟草的油酸含量变化不同，说明雪莲sikSAD基因的表达模式与拟南芥fab2基因的存在差异。利用相同的fab2基因的启动子分别驱动sikSAD基因和拟南芥fab2基因，转sikSAD基因的转基因烟草抗寒能力明显强于fab2基因，表现在低温条件sikSAD比fab2具有更强的催化硬酸酸转化为油酸的能力。分析其差异的可能主要是由于，sikSAD蛋白的α螺旋和β折叠均多于fab2蛋白，说明柔韧性强于优于fab2蛋白。.预期研究成果(1).完成本项目的研究，揭示sikSAD基因的低温响应机制，对应用前景进行评价。.(2).培养研究生3-5名，在国内核心刊物上发表论文2篇，SCI文章1-2篇。(3).申请国家专利1项。完成情况.1．.本研究揭示了天山雪莲sikSAD基因比拟南芥的同源fab2基因具有更强的低温催化能力，转基因植物的抗寒性的高低与膜脂中油酸的含量变化呈著的正相关。同时，天山雪莲sikSAD基因和拟南芥的同源fab2基因在低温条件下的表达模式存在很大的不同，说明这两种不同生态型的植物响应低温变化的