胆汁淤积中Ezrin下调肝细胞顶膜MRP2定位表达的分子机制研究

MRP2存在于极性化肝细胞膜的小管面（顶膜），是参与胆汁淤积发生的重要基因。胆汁淤积时MRP2蛋白表达急剧下降，其机制尚不清楚。胆汁淤积动物模型中Radixin相关的内吞可能导致了MRP2的减少，在人肝细胞尚无研究报道。我们前期对人胆汁淤积肝组织的研究初步发现：MRP2低表达与PKCs激活-Ezrin磷酸化-F actin重排相关，可能是与动物模型不同的致MRP2内吞的机制。本课题将围绕这一设想，首先研究明确胆汁淤积下被激活的PKCs调控了Ezrin磷酸化及可能的位点；其次，利用knockout小鼠、基因点突变、siRNA等技术证实磷酸化的Ezrin是F-actin重排、MRP2顶膜定位表达的关键衔接点，明确其为MRP2内吞的主要因素；最后，证明泛素连接酶E3s是否参与了内吞后MRP2的降解。从而全面揭示人胆汁淤积下肝细胞顶膜MRP2减少的分子机制，为胆汁淤积的临床治疗提供重要的理论依据。

项目背景：.MRP2是参与胆汁淤积发生的重要基因。胆汁淤积时MRP2蛋白表达急剧下降，机制尚不清楚。胆汁淤积动物模型中，MRP2的减少可能与Radixin相关。我们前期研究发现：人胆汁淤积时，MRP2减少可能与Ezrin的磷酸化相关，这可能是与动物模型不同的导致MRP2内吞的分子机制。.主要研究内容：. 1、明确人胆汁淤积状态下PKCs是否被激活及其是否可调控Ezrin Thr567位点磷酸化；. 2、确定Thr567位点磷酸化的Ezrin能否与MRP2、F-actin形成多蛋白复合体；. 3、明确Thr567位点磷酸化的Ezrin是导致F-actin重排、肝细胞顶膜MRP2发生内吞的关键因素；. 4、确定蛋白酶体降解途径（ERAD）的三种关键泛素连接酶（GP78、TEB4或HRD1）是否参与胆汁淤积状态下肝细胞内吞的MRP2的降解过程。.关键数据：. 1、阻塞性胆汁淤积人肝脏MRP2 mRNA无明显变化，而肝细胞顶膜MRP2表达显著减少、总蛋白MRP2表达也明显减少；. 2、阻塞性胆汁淤积人肝脏组织中，MRP2的表达减少与骨架蛋白Ezrin表达相关，而非与Radixin相关；. 3、Ezrin Thr567磷酸化水平在胆汁淤积肝脏显著增高，其脱磷酸化可影响Ezrin与MRP2蛋白间的相互作用。. 4、在HepG2稳定转染细胞株水平，Ezrin Thr567磷酸化可明显减少肝细胞膜MRP2的表达。. 5、阻塞性胆汁淤积下PKC表达显著增加。通过组织和细胞水平实验证明，PKCα可诱导Ezrin Thr567磷酸化，减少HepG2细胞膜上MRP2的表达。. 6、阻塞性胆汁淤积下泛素连接酶E3 gp78表达和MRP2泛素化明显增加。在HepG2稳定转染细胞株，gp78干扰后可增强总蛋白MRP2的表达。. 以上结果表明，胆汁淤积时MRP2表达下调为转录后调控：PKCα激活后，诱导Ezrin Thr567磷酸化，促使膜MRP2内吞，最后由泛素连接酶E3 gp78介导的蛋白酶体降解途径降解。.科学意义：. 本研究阐明了胆汁淤积时MRP2的转录后分子调控机制,完善了胆汁淤积分子的发生机制，深化了对胆汁淤积的认识，为临床治疗胆汁淤积提供了新的思路。