粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对脑出血中血红蛋白激活小胶质细胞抗炎作用机制研究

In previous work we found that Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF) not only inhibits the NF-κB protein expression and transcriptional activity in microglial cells activated by hemoglobin but also suppressed inflammatory reaction and neuronal apoptosis in rats with intracerebral hemorrhage, suggesting that G-CSF may plays an important role in NF-κB mediate inflammatory responses in intracerebral hemorrhage, but the exact mechanism of is unclear. In this study we investigate the effect of G-CSF on NF-κB activation in hemoglobin-stimulated primary rats microglia, autologous blood-induced rat intracerebral hemorrhage. In addition, using immunoprecipitation, western blot, electrophoretic mobility shift assay, and flow cytometer to determine how G-CSF regulates the NF-κB signaling pathway. Furthermore, using rats intracerebral hemorrhage models to explore the role of G-CSF in NF-κB signaling pathway. This research may provide a new molecular target for therapeutic intervention in human intracerebral hemorrhage diseases.

本课题组在前期工作中发现粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对血红蛋白激活原代小胶质细胞中NF-κB蛋白的表达和转录活性及大鼠脑出血炎症反应有明显的抑制作用，因此认为G-CSF可能干预了脑出血中NF-κB信号转导途经介导的炎症反应，然而其确切机理尚不清楚。项目内容拟对G-CSF干预脑出血中炎症反应的作用机制进行研究。采用体内外相结合实验，通过免疫共沉淀，免疫蛋白印迹、电泳泳动度移动和流式细胞等现代分析技术，以NF-κB为切入点，探索G-CSF对NF-κB信号转导通路的调控机制，并利用自体血注入法建立大鼠脑出血模型探讨G-CSF对脑出血后小胶质细胞活性的调节机制以及对血肿的清除作用的影响。通过本项目研究可以阐明G-CSF干预NF-κB信号转导通路介导的激活小胶质细胞致炎作用的分子机制，研究结果将为G-CSF治疗脑出血提供一个新的思路和方向。

粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF）是体内一种多肽链的细胞生长因子，尚未见国内外有解析G-CSF如何调节脑出血后小胶质细胞的致炎作用，以及增加其吞噬血红蛋白能力的研究报道。本研究（1）以经典Mc Carthy的小胶质培养方法为基础，用梯度离心法分离纯化小胶质细胞，对小胶质细胞分离、培养。利用ELISA明确观察到G-CSF可以抑制胶质细胞上清液中IL-1和TNF-α的分泌；利用QRT-PCR明确观察到G-CSF抑制胶质细胞中IL-1、TNF-α mRNA的表达；利用Western blot明确观察到G-CSF抑制了p-JNK和p-p38MAPK的表达。其次对（2）在Hb的存在下，探究G-CSF对激活小胶质细胞吞噬能力的调节及调节机制的影响。利用氰化血红蛋白比色法明确观察到G-CSF促进上清液中Hb的吸收；利用免疫荧光检测G-CSF促进小胶质细胞中CD163表达；利用实时定量PCR检测G-CSF促进小胶质细胞中CD163/HO-1 mRNA的表达；利用Western blot检测G-CSF促进小胶质细胞中HO-1表达。G-CSF可通过促进CD163/HO-1 mRNA合成，使CD163/HO-1在小胶质细胞中高表达而促进血红蛋白的吸收和代谢，在脑出血后起到神经保护作用。利用自体血注入法建立大鼠脑出血模型，观察到G-CSF可以抑制脑出血局部组织中TNF-α和IL-6 mRNA的表达并且抑制iNOS和COX2的蛋白表达。（3）本研究团队进行G-CSF作用机制的研究，为脑出血的治疗提供一个新的思路和方向。