DKK3调控大鼠牙囊干细胞增殖和分化作用的研究

The dental follicle contains multi-lineage potential stem cells, which could be used as seed cells for tooth regeneration. It was reported that numbers of signaling pathways control the dental follicle stem cells (DFSCs) differentiation. Tooth regeneration seems to be always a widely studied topic recently. Our previous study demonstrated that canonical Wnt signaling may promote the osteoblast/cementoblast differentiation of dental follicle cells (DFCs). The Wnt PCR array selected that the expression of DKK3 gene was down-regulated after the mineralized induction to DFCs, and WB results also proved the DKK3 protein level was obviously depressed. Due to the DKK families are inhibitors of Wnt signaling, we speculate that Dkk3 plays an important role in otseoblast/cementoblast differentiation of DFCs, thus may provide a new target for tooth regeneration using DFSCs. This study aims to isolate and culutre rat DFSCs, followed by treatment of recombinant DKK3 or shRNA-DKK3 transfection, to observe their effects on Wnt canonical signaling, proliferation and differentiation. Then the transfected cells combined with PLGA scaffolds will be transplanted to SCID rice, in order to determine the in vivo effect. The study will provide a novel idea for tooth regeneration.

牙囊中含具备多向分化潜能的干细胞，可作为牙再生的种子细胞。牙囊干细胞（DFSCs）的分化需要多种信号通路的相互作用调节，定向诱导DFSCs再生牙一直是近年来的研究热点。本课题组前期研究发现Wnt经典通路可正向调节牙囊细胞(DFCs)的成骨/成牙骨质向分化，采用Wnt基因芯片筛选出DFCs受矿化诱导后Dickkopf-3（DKK3）基因表达明显下调，蛋白印迹实验证实DKK3蛋白表达显著降低。DKK家族是Wnt信号通路的抑制因子，据此推测DKK3可能在DFCs的成骨/成牙骨质向分化中发挥重要作用，DKK3可能成为实现DFSCs诱导牙再生的重要靶点。因此，本课题拟培养分离大鼠DFSCs，用DKK3重组蛋白处理及构建DKK3稳定干扰细胞，观察对Wnt经典通路、增殖和分化的影响，了解DKK3作用的分子机制，并将转染细胞结合PLGA支架移植于SCID小鼠皮下，进一步从体内验证，为调控牙再生提供新思路。

牙囊中含具备多向分化潜能的干细胞，可作为牙再生的种子细胞。牙囊干细胞（DFSCs）的分化需要多种信号通路的相互作用调节，定向诱导DFSCs再生牙一直是近年来的研究热点。本课题组前期研究发现Wnt经典通路可正向调节牙囊细胞(DFCs)的成骨/成牙骨质向分化，采用Wnt基因芯片筛选出DFCs受矿化诱导后Dickkopf-3（DKK3）基因表达明显下调，蛋白印迹实验证实DKK3蛋白表达显著降低。DKK 家族是Wnt信号通路的抑制因子，据此推测 DKK3 可能在DFCs的成骨/成牙骨质向分化中发挥重要作用，DKK3可能成为实现DFSCs导牙再生的重要靶点。本课题拟探讨 DKK3 对大鼠牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化的影响。首先检测DKK3在出生后 1-15d大鼠牙囊中的表达，并分析大鼠牙囊细胞体外成骨向诱导4w后DKK3的表达差异。此外，通过慢病毒载体稳定转染构建DKK3稳定过表达和稳定干扰的牙囊细胞株，观察DKK3对牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化的影响。同时，将DKK3稳定过表达和干扰牙囊细胞植入免疫缺陷小鼠体内，观察DKK3对牙囊细胞体内成骨/成牙骨质向分化的影响。结论证实DKK3稳定干扰对牙囊细胞增殖无明显影响，能促进牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化并增强其体外矿化能力，同时促进β-catenin核转位；DKK3过表达抑制牙囊细胞增殖，降低牙囊细胞体外矿化能力并抑制其成骨/成牙骨质向分化，抑制β-catenin核转位，为研究DKK3在牙发育及牙再生调控中的作用提供了有力的理论依据。此外，本课题还研究了白细胞介素-1α（Interleukin-1alpha，IL-1α）和集落刺激因子-1（Colony-Stimulating Factor-1，CSF-1）对体外培养大鼠牙囊细胞骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）表达的影响，以及 IL-1α和CSF-1 刺激后牙囊细胞蛋白质组的变化。结论证明IL-1α、CSF-1 均可上调大鼠牙囊细胞 OPG蛋白水平，提示IL-1α或CSF-1可能同时具有促进牙囊细胞成骨向分化作用，为研究IL-1α和CSF-1在牙萌出中作用提供了新的视角。获得了 IL-1α、CSF-1 刺激后大鼠牙囊细胞的差异蛋白表达谱，筛选出Vimentin、Actin、HSP-β1、Cullin-5、Rab-3D等表达有差异的蛋白质，western blot