HBV 基因变异检测及其临床个体化应用研究

Recent studies indicated that the genetic variation of hepatitis B virus (HBV) is among the most important factors causing different pathological results in HBV-related liver diseases. The discovery of genetic variations including nucleos (t)ide analogue (NA) resistant (NAr) mutations, the pathogenesis of genetic variations on diseases course and prognosis, the impacts of mutation/deletion/insertion on markers of HBV infections are among the hot topics in individualized researches of HBV-related diseases. This project is designed based on the previous research findings supported by NSFC (81171664, 30770994,30270605 ) on HBV mutations by Sanger-sequencing and individual genetic susceptibility to liver cancer and cirrhosis/fibrosis. The HBV genome sequences with important functional significances as well as those with higher mutation frequencies will be intensively studied with next gene sequencing (NGS), and their clinical implications and mechanical explanation will then be explored. This study aims to 1) establish a high throughput, high sensitive and feasible method to detect the HBV genome variations including drug associated mutations to guide individualized therapy; 2) elucidate the pathological roles of HBV genome variations during inflammation-carcinogenesis transition and the progression of hepatocellular carcinoma so as to assist surveillance the high risk population and establish the individualized follow-up strategy. 3) assist the pertinent clinical explanation of HBV infection markers detected. This study will provide solid methodology and theoretical support for practicing individualized medicine in HBV-related liver diseases.

最新研究表明乙型肝炎病毒(HBV)变异是导致HBV相关肝病不同病理结局及炎-癌转变的重要因素。HBV多耐药位点(Nar)等基因变异位点的发现和检测、HBV基因变异对HBV相关肝病疾病进程和预后中的作用及其对于临床乙型肝病感染标志物的影响等是目前HBV相关肝病个体化研究的热点。本项目拟在前期3项NSFC资助研究HBV相关肝病个体化遗传背景及HBV全基因组一代测序研究发现的基础上，针对HBV基因组中具有重要功能意义的主要区段和一代测序中高频突变位点，进行二代（深度）测序和临床及分子机制研究，旨在建立高通量、高灵敏度且适宜临床应用的包括HBV-NAr在内的基因变异检测技术，以指导临床个体化抗病毒治疗；阐述HBV基因变异在炎-癌及原发性肝癌演进中的作用，辅助监测原发性肝癌高危人群并指导临床制定个体化随访策略；辅助HBV 感染标志物的正确解读和临床诠释。实现HBV相关肝病的个体化诊疗。

HBV基因由四个部分重叠的开放阅读框组成（C,P,S,X）。HBV在患者体内以混和“准种”形式存在。这些变异准种在HBV相关原发性肝癌（HCC）的发生发展中发挥重要作用。基于Sanger测序的克隆测序，尽管能在一定程度上反映病毒复杂度，但该方法仅只获得有限量的HBV序列数，不能真实还原患者体内所有的HBV基因突变以及所有HBV准种复杂度。越来越多研究表明，结合HBV多突变预测HCC发生发展比单个突变更加精准。目前罕有基于下一代测序（NGS）研究HBV RT区等与HCC等疾病进展的关系。. 本项目在前期工作基础上，分别针对RT/S、PreS、PreC/C等区，建立了基于illumina NGS测序技术，并依据临床适宜性，分别进行了临床转化应用以及部分关键位点的功能研究：1）RT/S区:自建了扩增子测序和窗口化生信分析流程，已通过方法学性能验证，目前已应用于临床HBV基因型、耐药位点的定量分析，检测敏感度达到5%（突变），为临床劣势耐药株的提前发现提供了重要手段。同时，多中心研究基于RT/S区的10种基因和蛋白特征构建了4种机器学习模型，发现随机森林（RF）模型可稳定地预测发生HCC的高危准种；RT/S区准种序列与HBsAg/HBsAb双阳性（免疫逃逸）有关。2）PreS区：研究发现不同基因型HCC、慢性乙型肝炎（CHB）与HCC的preS区序列特征及缺失特征均存在显著差异。采用Word Pattern Frequency方法构建了k最近邻（kNN）和支持向量机（SVM）分类器，具有较高的HCC预测准确度；3）HBV preC/C区的研究表明，同一患者肿瘤与癌旁的HBV preC/C区进化距离与血清及肝内HBV DNA水平呈显著负相关。携带HBc S87突变的HCC患者，其血清HBV DNA与肝内HBV DNA无显著相关性。4）构建了携带HBx及其P36T、K118T突变体的真核表达质粒，HBx及其突变体促进了细胞的增殖与侵袭，但HBx及其P36T突变体、K118T突变体对细胞功能影响无显著差异。. 本项目系列自建了NGS扩增子测序平台，结合机器学习算法，构建了多个基于NGS的HCC预测模型，为辅助临床HBV高危准种（HCC发生进展、免疫逃逸）发现和临床应用提供了新手段。自建的基于NGS的HBV基因型和耐药位点变异定量检测已经进入临床应用。