从caspase途径探讨阳和化岩汤对乳腺癌癌前病变细胞凋亡的干预机制

课题旨在探讨温阳通滞经方阳和化岩汤对乳腺癌癌前病变细胞凋亡caspase信号转导途径的调控作用，发掘有效中医治法和方药。总结历代中医学术特点，认为肾虚冲任失调、寒痰瘀血凝结是癌前病变主要病因病机，提出从"温阳通滞"论治的法则，筛选"阳和化岩汤"进行研究；根据乳腺癌发生规律以及癌变特点，采用目前最符合人体癌变过程的MCF-10AT细胞，进行细胞培养和裸鼠异种移植，从体外和体内两方面建立癌前病变模型；通过透射电镜、流式细胞术、免疫组化、TUNEL、RT-PCR、Western技术，检测凋亡caspase信号转导途径中膜受体通路分子（Fas、FasL、Caspase8）、线粒体通路分子（细胞色素C、Caspase9）、Caspase3及调控基因Bcl-2、P53、细胞增殖因子ki67的表达情况，探讨乳腺癌发生过程中增殖、凋亡和调控基因相互关系及两条转导通路关系，揭示阳和化岩汤的作用靶点和机制。

背景：乳腺癌是一种严重危害女性身心健康的常见恶性肿瘤，乳腺癌发病率不断上升，加强中医“治病于未然”思想，重视乳腺癌的预防工作，将具有现实社会意义和经济意义。本课题在中医理论指导下，建立大鼠乳腺癌癌前病变疾病模型和培养MCF-10AT人乳腺癌癌前病变细胞株，通过体内和体外实验，从细胞增殖和凋亡方面探讨温阳散结法代表方阳和化岩汤对大鼠乳腺癌癌前病变的抑制作用及机理，为中医药治疗提供基础研究。方法：体内实验部分采用DMBA诱导建立大鼠乳腺癌癌前病变模型，9周后分组用药干预治疗4周，观察大鼠体重增长及肿瘤出现情况，取乳腺组织HE染色观察组织形态，透射电镜观察细胞形态和超微结构，免疫组化法检测细胞增殖因子ki67、细胞凋亡相关因子caspase3、caspase8、caspase9、Fas、FasL及细胞凋亡调控因子Bcl-2、P53的蛋白表达，Q-PCR检测ki67、Fas、Bcl-2、P53的mRNA表达。体外实验部分采用MCF-10AT人乳腺癌癌前病变细胞株，MTT 法观察24h、48h、72h药物对细胞的生长抑制率，流式细胞仪测定药物干预72h后细胞凋亡率和细胞周期的变化，免疫细胞化学法检测Ki67、Caspase-3、Caspase-8、FAS、细胞色素C、P53、Bcl-2的蛋白表达，Western blot法检测Fas、FasL、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax 及Bcl-2的蛋白表达，半定量RT-PCR法检测Ki67、Caspase-3、Caspase-8、FAS、P53、Bcl-2的mRNA表达。结果：本研究通过体内动物实验，验证阳和化岩汤具有干预逆转乳腺癌癌前病变的作用，可改善细胞形态和超微结构，并具有增强Fas、抑制ki67、P53、Bcl-2蛋白和mRNA表达的作用，具有降低FasL、增强caspase3、8、9蛋白表达的作用。通过体外细胞实验显示阳和化岩汤对MCF-10AT细胞具有明显生长抑制作用，且随着作用时间延长抑制率逐渐增加，细胞凋亡率明显增高，呈现时间依赖效应；诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于S期；能够显著抑制激活caspase- 3 caspase- 9 的凋亡通路，促进caspase- 8、caspase- 3、Fas 、细胞色素C mRNA及蛋白表达水平，抑制Bcl- 2、ki67 mRNA及蛋白表达水平。