TRPV1的适配子在神经病理性疼痛中的镇痛作用及其可能机制

Neuropathic pain is defined as “pain caused by a lesion or disease of the somatosensory system”. TRPV1 is the new drug target of analgesia because it adjusts the upstream of the pain transmission on different pathways. But many small molecular TRPV1 antagonist have thermal hyperthermia and other limitations. It’s essential to search more specific and selective TRPV1 antagonist to modulation of pain. Aptamers are more specifically bind and inhibit the function of the target protein using SELEX technology and are also called "chemical antibody". We have good experience in aptamer research, and our previously research indicated that synaptic NMDA receptor is important in neuropathic pain. We will acquire the TRPV1 aptamers, indentify their characteristics, and explore the analgesia effects and mechanism of the TRPV1 aptamers on cells, slices, CCI animal models using technology of molecular biology, electrophysiology, behavior, site-directed mutagenesis and so on. The goals of the project is to explore feasibility of TRPV1 aptamers as specific small molecular antagonists to the therapy of neuropathic pain. It can provide the research foundation of chronic neuropathic pain and provide a theoretic and practical basis for research and drug development of new analgecics.

神经病理性疼痛是一种创伤或疾病累及躯体感觉系统后直接导致的疼痛。TRPV1在许多疼痛传导途径的上游区调节，是开发新型镇痛药物的靶点，但多数小分子TRPV1拮抗剂会产生体温过高等副作用，所以药物开发转向研发专一和选择性作用于调节疼痛功能的TPPV1拮抗剂。适配子是通过SELEX技术筛选得到的高特异结合和抑制蛋白质功能的寡核苷酸，被称为“化学性抗体”。我们有很好的适配子研究经验，且前期研究表明脊髓背角突触的NMDA受体在神经病理痛中起重要作用。本课题拟用SELEX技术筛选得到TRPV1适配子，采用分子生物学、电生理、行为学、定点突变等技术在DRG、脊髓切片、动物模型中进行TRPV1适配子镇痛作用及机制研究；探讨TRPV1适配子作为小分子拮抗剂治疗神经病理性疼痛的可行性及在神经痛中TRPV1和NMDA受体之间可能存在的联系，为慢性痛发生机制提供研究基础，为新型镇痛药的研发提供理论和实践依据。

TRPV1蛋白主要在小直径的初级感觉神经元表达，是神经病理性疼痛的重要靶标。TRPV1抑制剂在体内外显示出很好的神经病理性疼痛治疗作用，但是也存在体温升高等副作用。SELEX技术可筛选出与靶蛋白高亲和力和高特异性结合的寡核苷酸，是一种高通量筛选药物筛选方法。本项目利用SELEX技术筛选出抑制TRPV1活性的适配子（aptamer），主要取得以下成果：（1）采用微孔板法进行SELEX筛选得到高亲和力的适配子，并进行克隆测序和二级结构预测；适配子的结合常数在nM水平；利用pull down和免疫荧光实验验证了适配子与TRPV1蛋白结合的特异性。（2）通过膜片钳技术发现适配子R1可以抑制表达TRPV1的细胞产生具有辣椒素诱导电流特征的内向电流；在DRG细胞上抑制内向电流的程度高于抑制外向电流。荧光探针检测实验提示适配子R1可以抑制TRPV1通道的激活，抑制表达在细胞上的TRPV1受体引起细胞内Ca2+浓度升高。（3）建立坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型，采用鞘内给药的方法进行实验，给药后检测机械性痛阈和温度的变化，并进行免疫荧光等实验。结果显示适配子R1比对照组有很好的镇痛效果，并且无体温升高等副作用。另外适配子R1作用于TRPV1后还可能通过进一步降低脊髓背角NR2B的表达来发挥镇痛作用。后续实验中我们继续进行体内外镇痛分子机制的探索工作。（4）AD相关适配子的研究：我们在经费的资助下进一步研究β分泌酶适配子和乙酰胆碱酯酶适配子在AD动物模型中的作用。这两种适配子均具有提高AD动物模型的认知障碍、减少Aβ产生等作用，可发展为AD潜在治疗药物。已发表1篇SCI论文并申请相关专利。以上结果对于建立SELEX筛选方法、适配子鉴定及其体内外作用研究等方面提供研究经验。本课题为研发以TRPV1为靶点的新型特异小分子拮抗剂提供新的技术平台和研究工具，为镇痛药物研发提供理论和实践依据。