针对胶质瘤干细胞的适配子携带Notch受体抑制剂的靶向增强放射敏感性

Radiotherapy is the main adjunct treatment for glioma and has some rediorsistance. Glioma stem cells have a decisive role in the growth, recurrence and concurrent chemoradiation resistance. But the membrane specific antigens of glioma stem cells and radioresitance mechanism is not well known. Our previous studies have showed that GSIs - a small molecule inhibitor to Notch signaling pathway could sensitized the radiation. We are going to screen the nucleic adic aptamers to glioma stem cells by cell-SELEX, and isloate and analysis the target proteins. We will combine the aptamers with the siRNAs of Notch receptor and/or HIF2α, and then are packed into long circulation liposomes to explore the mechanism of its enhancing glioma stem cells'radiosensitivity in vitro and in vivo. The research not only provide useful informations in the basic research to glioma stem cells, but also are useful for clarifying the relationship and mechanism of Notch signaling pathway and hypoxia in radiotherapy sensitivity of glioma.

放射治疗是胶质瘤的主要辅助治疗手段，但存在一定的放射抗拒。胶质瘤干细胞在引发并维持胶质瘤生长、复发及放化疗抗性中起着决定作用，也是放射抗拒产生的主要原因。但关于脑肿瘤干细胞的表面特异抗原以及其放射抗拒机制等方面的研究不够深入。Notch信号通路与胶质瘤干细胞增殖、低氧和血管增生等方面密切相关。我们以前的研究显示Notch信号通路的小分子抑制剂（GSIs）可有效增强胶质瘤干细胞的放射敏感性。本项目拟通过cell-SELEX技术来筛选出针对胶质瘤干细胞的核酸适配子，并对其靶标蛋白进行分析和鉴定。将得到的适配子与Notch受体和/或HIF2α的siRNA结合，并制备成长循环脂质体等新型纳米载药技术在细胞水平和动物模型上进行增强胶质瘤干细胞放射敏感性的分子机制研究。本研究不仅为胶质瘤干细胞的基础研究提供有用的信息，同时有利于阐明Notch信号通路和缺氧在胶质瘤放疗敏感性中的相互关系及其分子机制。

本课题采用细胞SELEX（cell-SELEX）方法筛选得到针对人胶质瘤干细胞（GSC）及其相关分子的适配子（aptamers），并探讨适配子携带Notch1 siRNA靶向增加胶质瘤放射敏感性的相关研究。主要取得以下创新性成果：（1）筛选得到针对人GSC分子标记prominin-1 （CD133）的核酸适配子并进行结合鉴定；（2）利用cell SELEX方法筛选得到针对GSC细胞的适配子，并进行克隆测序和二级结构预测。适配子C4可特异结合GSC细胞，Kd值在nM水平，显示很高的细胞结合力。通过细胞免疫荧光和流式细胞检测进一步证明适配子与GSC细胞结合的特异性；（3）同时利用cell SELEX技术筛选了针对U87-EGFRvIII的适配子U2，其结合的靶分子为突变蛋白EGFRvIII。EGFRvIII可使胶质瘤细胞具有更高的增殖、侵袭和放化疗抗性，可能与GSC相关；（4）发现GSC细胞可能的新分子标记：C4为配基的pull down实验得到3个结合蛋白质，目前正在鉴定中；另外的实验表明EGFRvIII分子可能是某些GSC细胞的新分子标记；（5）得到的GSC适配子C4和EGFRvIII适配子U2均被相应靶细胞内吞，激光共聚焦检测发现这两个适配子都具有进入靶细胞的胞浆和核内的作用，这些适配子可作为载体运载siRNA、药物和荧光等，副作用少，靶向性强，而没有病毒或脂质体的毒性；（6）制备了以肝素为载体，负载靶向配基适配子、notch1 siRNA和Tat肽的纳米粒子并进行鉴定；（7）制备的纳米粒子可以在胶质瘤干细胞的细胞和动物模型上靶向增强胶质瘤的放射敏感性，抑制肿瘤生长等作用。以上研究结果对于建立成功筛选cell SELEX方法、适配子特性鉴定、适配子介导的纳米粒子的制备等方面提供研究经验；对于探讨适配子携带siRNA等协同增加肿瘤放射敏感性研究提供新的研究基础；为分子靶向治疗胶质瘤干细胞提供新的途径和方法。