基于CRISPR/Cas9技术的哈密瓜多抗病毒病非转基因材料创制研究

Virus disease is one of the major diseases damaging melon production in XinJiang Province, and it becomes a main restriction factor for late maturing melon production in XinJiang Province. Till date there is no effective control for viral disease and there are no multi viral resistant muskmelon materials. This project aims to use CRISPR/CAS technology to disrupt the function of recessive eIF4E (eukaryotic translation initiation factor 4E) gene and therefore conferring virus resistance in muskmelon materials using golden gate cloning method. We will construct four CRISPR/CAS vectors which specifically targets eIF4E and use agro bacterium mediated transformation method to transform cultivated varieties JiaShiGua and HoungHou. The genome editied transgenic plants will be screened using PCR techniques to select non trasngenic gene edited plants from T1 and T2 transgenic plants. The different genome edited plants will be tested for resistance to WMV, CMV and ZYMV virus and select virus resistance plants. Real-Time PCR, genome sequencing and western blotting methods will be used to compare the gene and protein expression levels in different plants. These comprehensive analyses of gene modification and expression of related genes and proteins in transgenic plants will reveal more information related to virus resistance mechanisms, and eventually provide materials for breeding new virus resistant muskmelons in Xinjiang.

病毒病一直是影响新疆瓜类作物种植的重要病害，并已成为我区晚熟瓜生产的主要限制因素。目前不仅没有有效防治病毒病的措施，而且未发现抗多种病毒病的哈密瓜材料。本项目利用CRISPR/Cas9技术定向敲除哈密瓜翻译起始因子（eIF4E），以获得哈密瓜抗病毒病材料为目的，通过Golden Gate克隆法，分别构建4个特异靶向eIF4E的CRISPR/Cas9载体 ，用农杆菌介导法转化常规品种皇后与伽师瓜中，获得基因编辑的转基因植株，通过特异性PCR检测，从T1与T2 转基因植株中，筛选出基因编辑的非转基因哈密瓜植株。通过对具有不同基因编辑效应的阳性转基因植株的WNV，CMV以及ZVMV病毒病的抗性进行检测，同时利用实时定量PCR、DNA测序以及蛋白质表达水平进行比较，对基因编辑植株的抗病性、基因修饰以及相关基因与蛋白表达进行综合分析，揭示抗病机理；为新疆瓜类作物抗病毒育种提供抗病材料与新的育种技术。

甜瓜（Cucumis melo L）,又称哈密瓜，被广泛种植于新疆天山南北多数绿洲地区,是新疆特色农作物之一。病毒病一直是影响新疆瓜类作物种植的重要病害，并已成为我区晚熟瓜生产的主要限制因素。本研究以“哈密瓜”为试料，以培育抗病毒材料创制及其抗病机理研究为切入点，开展了以下工作：.① 建立甜瓜7种病毒病的多重RT-PCR检测体系，对新疆甜瓜主栽区主要病毒病进行的检测，确定WMV、ZYMV、CMV为引起新疆甜瓜病毒病的优势种；②基于CRISPR/CAS9技术对哈密瓜翻译起始因子（eif4e）基因中选择了6个靶标位点，构建CRISPR/CAS9双元载体，用农杆菌介导法转化常规品种皇后与伽师瓜中，获得基因编辑的转基因植株，通过PCR检测，筛选出基因编辑的非转基因哈密瓜植株；③甜瓜主要病毒病WMV、ZYMV、CMV的纯化、保存及抗病性检测方法的建立，对基因编辑植株进行抗病性检测，同时对基因表达水平进行比较；④以新疆采集的CABYV分离物作为材料，对其构建侵染性克隆；⑤对不同株系靶标基因的基因表达量进行分析、各片段在 CRSPR/CAS9 中的效能进行评价；本研究今后对新疆哈密瓜抗病毒育种和抗病材料创制有重要的应用价值。执行项目期间，发表文章SCI文章1篇，获得国家发明专利2项；投稿SCI文章1篇；获得软著著作权1项；正培养研究生1名。