应用CRISPR/Cas9技术阻断伪狂犬病病毒潜伏再激活的研究

Pseudorabies virus (PRV) is a neurotropic alphaherpesvirus, which can infect pigs, cattle, sheep and other animals. PRV can establish a latent infection in the sensory neurons and can be reactivated under stress, resulting in clinical signs. Pigs with undetectable anti-PRV antibodies can be latently infected with PRV, but currently available PRV vaccines cannot prevent the virus from establishing a latent infection. The 2.0-kb LAT, EP0, and IE180 are the critical genes involved in PRV reactivation. In this proposal, we will screen efficient sgRNAs targeting the above genes and generate a recombinant PRV harboring the sgRNAs and Cas9 expression cassettes in the largest latency transcript gene locus of a gE/gI/TK-deleted PRV vaccine candidate using bacterial artificial chromosome. Next, we will evaluate the effectiveness of the recombinant PRV to eliminate quiescent PRV genomes in primary mouse neurons and mouse models. This study is expected to develop a candidate pseudorabies vaccine that functions as both blocking agent and efficacious vaccine for arresting PRV latency-reactivation as well as preventing PRV infections, thus providing an effective tool for control and eradication of pseudorabies and a reference for the prevention and treatment of human herpesviral infections.

伪狂犬病病毒（PRV）是一种具有神经嗜性的α疱疹病毒，可感染猪、牛、羊等多种动物。PRV可在感觉神经元内建立潜伏感染，在一定条件下可被再激活从而引起发病。现地中，有些猪虽然检测不到抗体，但体内存在潜伏感染的PRV，而现有伪狂犬病疫苗不能阻止该病毒建立潜伏感染。2.0-kb LAT、IE180和EP0是参与PRV再激活的关键基因。本项目拟首先以上述基因为靶标，体外筛选可有效阻断PRV再激活的sgRNA；其次，对sgRNA的靶基因进行同义突变，并以gE/gI/TK三基因缺失的PRV变异株为载体构建含有sgRNA和Cas9表达框的重组病毒；最后，在小鼠神经细胞及小鼠模型上评价此重组病毒阻断PRV再激活的效果。本研究可望获得兼具阻断PRV潜伏再激活和预防PRV感染双重功能的候选疫苗株，为伪狂犬病的防控及净化提供新的工具，同时为人类疱疹病毒潜伏感染的防治提供借鉴。

伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）是一种嗜神经性病毒，感染猪只后，可在其体内建立潜伏感染。在一定条件下潜伏状态的PRV可以被重新激活，从而导致排毒并引发疫情，这非常不利于伪狂犬病的防控及根除。本研究首先利用同源重组的方法构建了2株重组报告病毒rPRVTJ-US9-EGFP和rPRVTJ-Nluc。rPRVTJ-US9-EGFP和rPRVTJ-Nluc感染PK-15细胞能够高效表达绿色和红色荧光蛋白，rPRVTJ-Nluc的Nluc荧光素酶活性强度与病毒滴度呈正相关；不同代次重组病毒的外源基因PCR鉴定均呈现阳性，说明外源基因遗传稳定，重组病毒生长特性与亲本病毒一致，说明外源基因的插入不影响病毒复制。我们通过分离新生鼠背根神经节建立感觉神经细胞体外培养方法，当重组rPRVTJ-US9-EGFP报告病毒以MOI = 0.001感染感觉神经元，0.5 mM ACV处理7 d后，可建立稳定的潜伏感染，当用10 μM的LY294002刺激时，潜伏感染的PRV可被再激活进入裂解感染状态。利用重组报告病毒rPRVTJ-Nluc初步筛选到抑制病毒复制的多个sgRNA，慢病毒载体表达的sgRNA能显著降低靶基因UL9、UL42、UL54和VP16的蛋白表达水平。进一步在体外潜伏感染模型上证实靶向PRV UL9基因sgRNA的重组慢病毒能够有效抑制PRV的再激活。.体内潜伏感染研究方面。rPRVTJ-NLu重组病毒 100，1000 和10000 TCID50眼角膜攻毒途径感染6周龄BALB/c小鼠，攻毒前一天小鼠腹腔注射PRV阳性血清，感染后3 d分离小鼠三叉神经节外植体接种vero细胞均能观察到红色荧光，其中仅有100 TCID50感染组小鼠全部存活，持续饲养小鼠20 d后，分离三叉神经节外植体接种vero细胞，持续观察6天均无荧光。将1000 和10000 TCID50 重组弱毒株rPRVTJ-delgE/gI/TK-EGFP眼角膜攻毒，以及10000和100000 TCID50后肢肌肉攻毒，存活的小鼠持续饲养20 d后，分离三叉神经节外植体接种vero细胞，2 d没有观察到荧光，6 d以后4个感染组均出现荧光，说明弱毒株经逆向神经传导进入三叉神经节，可以建立潜伏感染，更适合用于小鼠潜伏感染的研究。本研究为研制清除潜伏感染能力的伪狂犬病疫苗奠定了基础。