大熊猫Y染色体遗传标记筛选与父系种群遗传学研究

Genetic variation, phylogeography, and population history are the research focuses of conservation genetics, and maternal mitochondrial DNA (mtDNA) and bi-parental autosomal markers are the most widely-used genetic markers. In contrast, the use of paternal Y-chromosome genetic markers is relatively rare due to a high proportion of repetitive sequences and lack of known Y-chromosome sequence information. The giant panda (Ailuropoda melanoleuca) is one of the most endangered species. Many conservation genetics studies have been performed based on mtDNA and autosomal markers in giant pandas; however, owing to the lack of Y-chromosome genetic markers, some interesting scientific problems await comprehensive investigation. In this study, we use genomics method based on next-generation sequencing, YCATS and cross-amplification methods to isolate Y-chromosome genetic markers of giant pandas. Then we use these isolated markers to study paternal genetic variation, phylogeography and population history, and compare Y-chromosome based results with mtDNA- and autosomal microsatellites-based results to test three hypotheses based on Y-chromosome genetic markers. These findings will comprehensively clarify the genetic variation, phylogeography and population history of giant pandas, and will have important implications for the management of wild populations and reintroduction.

濒危物种的遗传变异、系统地理格局和种群历史是保护遗传学研究的核心内容，目前应用最多的遗传标记是呈母系遗传的线粒体DNA（mtDNA）和呈双亲遗传的常染色体标记，而呈父系遗传的Y染色体标记的应用相对很少，其主要原因是Y染色体具有较高比例的重复序列及缺乏已知的序列信息。大熊猫是世界最珍稀的濒危物种之一，基于mtDNA和常染色体标记的保护遗传学已开展了许多工作，然而由于缺乏Y染色体遗传标记研究，一些重要的种群遗传学问题并未得到全面的阐明。本研究拟采用基于第二代测序的基因组学方法，结合使用YCATS和交叉扩增方法，筛选大熊猫Y染色体遗传标记；然后研究大熊猫父系的遗传变异、系统地理格局和种群历史，并与基于mtDNA和常染色体微卫星标记的研究结果相比较，以检验基于Y染色体遗传标记的3个假设，以期全面阐明大熊猫的遗传变异、系统地理格局和种群历史。研究结果将对大熊猫的野生种群管理和放归具有重要的指导意义。

本项目使用了基于Y染色体的基因组学方法、YCATS方法和交叉扩增方法开发大熊猫Y染色体雄性特异的遗传标记，以用于大熊猫父系种群遗传学研究，以期从父系遗传角度揭示大熊猫的遗传多样性、系统地理格局、种群遗传结构和种群历史动态，并与母系遗传的线粒体基因组分析结果相比较，以全面揭示大熊猫的种群遗传面貌。研究结果发现，基于Y染色体的基因组学方法共开发出有多态性的Y染色体雄性特异的SNP标记11个和微卫星标记6个，而YCATS和交叉扩增方法未筛选到有多态性的Y染色体雄性特异标记。应用这11个Y-SNPs和6个Y染色体微卫星标记，对33只来自秦岭/岷山/邛崃/凉山山系的野生雄性大熊猫进行遗传分型和种群遗传学分析，结果共鉴定7种SNP单倍型和15种微卫星单倍型，SNP单倍型多样性和微卫星平均等位基因数分别为0.839和4.2。对Y-SNP单倍型和Y染色体微卫星单倍型的系统发育树和Network网络图分析均显示，来自秦岭山系的单倍型和来自岷山/邛崃/凉山山系的单倍型分别聚为2支，呈现明显的系统地理格局。同时，我们也对35只野生雌性大熊猫的线粒体全基因组进行了测序分析，共鉴定27个线粒体单倍型，单倍型多样性0.9748，核苷酸多样性0.00198。线粒体基因组的系统发育树和Network网络图分析显示，来自各山系的单倍型呈无规律的分布，无明显的系统地理格局。上述结果说明，大熊猫整体的系统地理格局是由雄性留居和雌性扩散介导的基因流综合形成的。秦岭种群与非秦岭种群有大的遗传分歧，可定义为两个进化显著单元。基于线粒体基因组的种群动态历史分析显示，大熊猫在2.5-1.5万年前由于末次冰期的影响而遭受了种群瓶颈，之后种群恢复并增长，但距今2000多年前，种群又开始发生下降。本研究全面厘清了大熊猫的系统地理格局全貌，加深了对大熊猫的种群遗传进化历史的认识，进化显著单元的鉴定有利于大熊猫科学保护对策的制定。