蛋白质纳米载体促进难溶性营养素的肠道吸收及其调控机制研究

Extremely low solubility in aqueous phase, poor light, heat, and oxygen stability, and low bioavailability in vitro limit its use in food industry and absorption by human beings. Protein-based nanoparticles delivery systems have been developed to encapsulate BC and protect the stability and enhance the absorption of β-carotene in our previous work. The transport process and mechanism in facilitating the absorption of nutraceuticals is unclear. Caco-2 cells and HepG2 cells were used as transport models to study the endocytosis, intracellular trafficking, and exocytosis of fluorescent probes-labelled protein-based nanoparticles under the effects of inhibitors of cells and their organelles in this project. The effects of emulsifiers types, conformation, structures, interfacial characteristics of nanoparticles and physicochemical properties and structures of nutrients were evaluated. Relevance of the biological characteristics and physicochemical properties of nanoparticles was estimated. Relevance of the features of nutraceuticals and the transport and absorption in Caco-2 cells is analyzed. The mechanisms of cellular uptake, intracellular trafficking, and exocytosis of protein-based nanoparticles were illustrated. The study in this project will efficiently provide directional guidelines in the establishment of high-effective nano-particles delivery systems of edible nutraceuticals.

具有重要生理活性难溶性营养素由于在水相中溶解度低，光、热和氧稳定性差以及生物利用率低，限制其在食品工业上的应用和被人体的消化吸收。前期研究发现纳米颗粒能够显著提高难溶性营养素的细胞摄取量。但是，目前对纳米颗粒的整个细胞转运过程和机理及其促进包埋营养素吸收机制尚不明确。本课题将利用Caco-2和HepG2细胞模型，研究细胞和胞内细胞器在抑制剂作用下，荧光探针标记的蛋白质纳米颗粒的细胞内吞方式、胞内转运路线和细胞外排途径以及各类细胞器作用机制。探索蛋白质乳化剂类型、空间构象和结构、纳米颗粒界面特性以及营养素结构和物理化学特性对纳米颗粒细胞转运吸收的影响，分析纳米颗粒物理化学特性和生物学特征与营养素生物利用率水平相关性，探讨营养素自身特性与细胞转运吸收相关性，阐明蛋白质纳米颗粒及其包埋营养素的细胞内吞、胞内转运和细胞外排机制。本研究对高效生物利用率食品营养素纳米载体体系的有效构建提供方向性指导。

本项目针对目前对于纳米颗粒的整个细胞转运过程和机理以及提高芯材营养素生物利用率机理不明确，本研究拟以蛋白质稳定的纳米颗粒为研究对象，通过乳化-蒸发法和反溶剂法制备蛋白质稳定的营养素纳米颗粒和构建单层Caco-2细胞模型为基础，系统开展难溶性营养素蛋白质纳米颗粒的转运吸收机制研究，全面探讨蛋白质纳米颗粒物理化学特性、生物学特征以及界面特性对功能性营养素转运吸收的影响机制，最后，分析营养素结构与细胞转运吸收相关性，为高效的食品营养素纳米载体体系的有效构建和应用提供理论基础。首先，研究发现不同蛋白质对营养素的负载和稳定具有显著影响。三种蛋白质纳米载体中β-胡萝卜素化学稳定性依次为：酪蛋白酸钠>乳清分离蛋白>大豆分离蛋白。纳米颗粒中的蛋白质分子可通过与营养素之间的相互作用、与营养素之间的界面效应以及自身的消化特性对营养素的增溶、保留和释放特性产生影响，进而对其细胞转运吸收产生影响。通过Caco-2细胞模型，发现纳米载体不同的粒径大小显著影响β-胡萝卜素细胞摄取量，粒径越低细胞摄取量越高。另外β-胡萝卜素的摄取量与蛋白质纳米颗粒ζ-电势直接存在着负相关关系，同时实验证实了营养素纳米颗粒的细胞摄取方式为具有时间和能量依赖的主动运输。在此基础上，采用系列细胞膜主动运输机制抑制实验分析了参与纳米载体细胞主动运输的细胞器，确定网格蛋白与小窑蛋白（脂筏）介导的内吞作用是营养素纳米载体细胞摄取的主要形式。最后，通过动物实验证实了蛋白质纳米载体可显著提高其在小鼠血液及肝脏中的含量，提高β-胡萝卜素的生物利用率。该研究结果可在一定程度上用于指导高生物利用率和生物活性负载营养素蛋白基纳米运输体系的构建。