芳香聚酮抗生素三欣卡辛生物合成相关的两个小蛋白功能研究

Discovery and study of new type of highly active natural products are helpful for supplement and upgrading of anticancer drugs, and the biosynthesis of natural products and combinatorial biosynthesis research are important ways to get more highly active drugs. Trioxacarcins with extraordinary antitumor activity and novel chemical structures are aromatic polyketides isolated from Streptomyces. The biosynthetic studies of trioxacarcins will clarify their complex biosynthetic processes in nature, which will be helpful for combinatorial biosynthesis to produce new antitumor drugs. This project will focus on function research of two unknown functional genes in the gene cluster (orf38 and orf44, coding proteins containing less than 160 amino acids), which based on the previous research results of the biosynthesis of trioxacarcins. Combining knockout in vivo, isolation and structural identification of intermediate, protein expression, enzymatic reaction in vitro and preliminary mechanism research, we will clarify functions of the two proteins in the biosynthesis of trioxacarcins. Furthermore，the results of the research will provide new insight into the function research of the two family of proteins widely in the nature.

发现和研究新型的高活性天然产物分子有助于对抗肿瘤药物种类进行补充和升级换代，而天然产物的生物合成及组合生物合成研究是获得更多高活性药物的重要途径。三欣卡辛是来源于链霉菌的芳香聚酮抗生素，具有良好的抗肿瘤活性和新颖的化学结构。对三欣卡辛生物合成的研究，将阐明这类复杂天然产物在自然界中的合成途径，同时有助于用组合生物合成方法产生新型抗肿瘤药物。本项目将在前期三欣卡辛的生物合成研究基础之上，对基因簇中两个未知功能基因（orf38和orf44，编码蛋白的氨基酸数目都小于160）进行研究，综合体内敲除、中间体分离鉴定、蛋白表达、体外酶催化反应及催化机理的初步研究，阐明这两个蛋白在三欣卡辛生物合成中的功能。研究结果将为自然界中广泛存在的、同时功能未知的这两类蛋白家族的研究提供新的思路。

复杂天然产物的生物合成研究，对于其产量的提高、抗性机制研究及后续的组合生物合成都具有重要的意义。三欣卡辛是来源于链霉菌的具有蒽环骨架的芳香聚酮类化合物，具有良好的抗肿瘤活性及独特的2，7-二氧取代的双环[2,2, 1]庚烷结构片段及环氧乙烷活性基团，引起了国际上许多化学家、生物学家的高度关注。本项目是在前期三欣卡辛生物合成的基础之上，对该基因簇中的两个未知功能基因（txn38和txn44）编码的小蛋白的功能进行研究。通过基因敲除、基因回补实验证实这两个基因都参与到三欣卡辛的生物合成途径。通过对突变株中间体的分离纯化和结构鉴定，我们得到了3个中间体化合物：γ-吡喃酮缺失的化合物（M-38A和M-38B）和9位去羟基三欣卡辛(M-44A)；通过E.coli进行蛋白表达，成功获得可溶性蛋白Txn38和Txn44，以所获得中间体进行酶活测试，结果表明，Txn38可以成功将中间体M-38A转化成新的产物，而Txn44则没有测到活性。后续对蛋白Txn38进行深入研究，酶活产物的结构鉴定，和底物进行对比，表明Txn38负责γ-吡喃酮的形成。通过对该蛋白的结构解析及复合物结构的确定，结合定点突变实验，我们提出了Txn38的酶催化机理：K10锚定底物、T146和E145协助催化的机制。鉴于数据库中其同源蛋白功能都是未知的，选择来源于Microtetra sporaglauca, Thermomono sporacurvata和Kitasato sporagriseola的同源蛋白Mic、Therm、Kit以及Hedmycin生物合成基因簇中HedB的N-端蛋白开展体外生化研究，结果表明它们都具有TxnO9类似的催化功能。进化树分析这些蛋白形成了一个不同于START家族中生理调节功能蛋白（MLN64，Bet v1）、环化芳香化功能（TcmN为例）及CalC抗性功能蛋白的全新的亚家族。总之，我们的工作一方面阐明了三欣卡辛中吡喃环的形成方式，另一方面丰富了START家族酶的功能。