芳香聚酮抗生素三卡辛的生物合成研究

Trioxacarcins, a group of antibiotics with novel polycyclic chromophores, were first isolated from the culture broth of Streptomyces bottropensis NRRL 12051. They are cytotoxic against various cultured human cancer cell lines. The potent antiproliferative effects of trioxacarcins may derive from their ability to covalently modify duplex DNA using the spiro-epoxide structure. The biosynthetic research of trioxacarcins will reveal specific pathways for these structures and set a stage to produce new anticancer antibiotics through combinatorial biosynthesis. Based on the partial cluster we identified in the previous research, we want to get the complete biosynthetic gene cluster of trioxacarcins by screening of genomic library. And its involvement in trioxacarcin biosynthesis will be confirmed by gene inactivation. Then we will adopt various methods to further character the biosynthetic pathway, including gene inactivation, structural identification of intermediate, biochemical assay, and isotope-tracer experiments. Focus of the research is the biosynthesis pathway of spiro-epoxide structure, which will be comprehended in two levels such as the molecular origin of the structure and the cyclization mechanism. The result will accelerate the discovery of type II polyketide synthase and facilitate the genetic modification of many first-line cancer drugs.

三卡辛是来源于链霉菌的芳香聚酮抗生素，具有良好的抗肿瘤活性和新颖的化学结构。三卡辛中的含氧三元螺环结构对于其发挥抗增殖活性具有至关重要的作用。对三卡辛中特殊结构的生物合成的研究，将首次阐明这类复杂天然产物在自然界中的合成途径，同时有助于用组合生物合成方法产生新型抗肿瘤抗生素。本项目将在已经获得部分生物合成基因簇的基础上，继续通过文库筛选的方法得到其完整基因簇，并采用体内基因敲除的方法验证基因簇功能和确定基因簇边界。然后综合基因敲除，中间产物的分离鉴定，蛋白表达与体外酶催化反应，以及同位素标记喂养等方法对其生物合成途径进行深入研究。我们主要关注三卡辛中特殊含氧三元螺环结构的形成，将从分子来源和环化机制两个层次阐明其生物合成途径。研究结果对于深入了解II型聚酮合酶的催化机制，以及对现有蒽环类抗肿瘤药物的结构改造都具有重要意义。

三欣卡辛是日本科学家从波卓链霉菌中分离得到的芳香聚酮类化合物，具有典型的蒽醌骨架，结构中含氧三元螺环是其重要的活性单元，可与DNA共价结合破坏其双链结构从而发挥其生物活性。该家族化合物具有良好的生物活性，包括抗革兰氏阳性菌、抗疟及抗肿瘤活性。研究其生物合成途径，对于获得更高活性的蒽环类抗肿瘤抗生素，了解新型聚酮化合物后修饰机制等方面都具有重要意义。.建立稳定高产的液体发酵模式，使三欣卡辛A的产量提高了近百倍。通过同位素标记的三种乙酸钠喂养实验，确定了聚酮链的生物合成走向。成功建立了该链霉菌体内遗传转移系统。建立高质量的基因文库，筛库获得三欣卡辛生物合成基因簇。以获得的基因簇为基础，我们开展了系统性的体内遗传和体外生化结合的功能研究，主要研究内容和结果如下：.通过基因簇中与骨架合成相关的14个基因的体内敲除实验，确定了这些基因编码的蛋白在三欣卡辛生物合成中可能的作用；并从突变株中分离得到了2个重要中间化合物。.根据同位素标记的氨基酸喂养实验证实起始单元来自于异亮氨酸中的五碳单元；根据四个基因的信息学分析及体内敲除实验，证实其在三欣卡辛合成中的重要性，根据实验结果提出了前体单元可能的合成途径。.通过对糖基合成相关的13个基因的信息学分析，提出两个糖基单元的生物合成方式；在突变株中成功分到五个与糖基相关的化合物；通过体内敲除实验确定了Txn50负责转移1号糖单元；并表达获得了糖基转移酶Txn45，Txn50的可溶性蛋白，进行了体外生化测试。.对三欣卡辛生物合成基因簇中四个细胞色素p450氧化酶的体内功能研究，分离并得到四个有价值的中间体化合物；表达并纯化了这四个氧化酶的重组蛋白。通过对三个氧甲基转移酶的体内功能研究，确定了其催化的相应位点；通过对其他后修饰基因的体内敲除实验结果分析，大致推测出这些基因在三欣卡辛生物合成中可能的功能。.对调控基因的体内敲除实验确定了这些基因在三欣卡辛生物合成中的重要性；确定基因簇中四种调节基因都属于正调控基因，证实正调控基因的多拷贝可以增加三欣卡辛的产量，这也为提高突变株中间体化合物的产量提供一种方法和手段。.基于上述体内、体外、标记前体喂养、中间化合物鉴定等实验结果，我们最终提出了一条三欣卡辛合理的生物合成途径。