ZBP-89调节HDAC3和DNMT1在调控BCL2家族参与的线粒体凋亡通路机制及在肝癌治疗中的作用

Transcription factor ZBP-89 plays an important role in hepatocellular carcinoma cell apoptosis, especially in mitochondrial-related pathway. ZBP-89 interacts with HDAC3 and DNMT1, suppresses their activity. Whether high expressed HDAC3 and DNMT1 are related with Bcl-2 family members expression balance. It is still unclear. The project employs Bcl-2 family gene chip and western blotting methods to study its expression level in hepatocellular carcinoma patients tissues. In order to study histones acetylation and DNA CpG islands methylation status, we will use co-immunoprecipitation, chromatin precipitation and methylation sequencing techniques. Human hepatocellular carcinoma xenograft model in nude mice will be carried out to explore the anti-cancer efficacy of inhibitors of HDAC3 and DNMT1 respectively or combined together. The project aims to reveal ZBP-89, and HDAC3 and DNMT1 which are regulated by ZBP-89, involved genetic and epigenetic regulation on Bcl-2 family members expression, to study histones acetylation and gene methylation in pro-/anti-apoptosis imbalance mechanism. The accomplishment of the current project will elucidate the mechanism of ZBP-89, HDAC3 and DNMT1 in regulation of Bcl-2 members expression , and anti-cancer effect of their inhibitors in hepatocellular carcinoma therapy.

转录因子ZBP-89在肝癌细胞线粒体凋亡途径起重要作用。肝癌高表达的HDAC3 和DNMT1活性受ZBP-89调节，前两者是否与Bcl-2蛋白家族抑/促凋亡蛋白表达失衡相关，目前尚没有深入研究。本项目采用Bcl-2家族表达谱基因芯片和蛋白印迹技术研究该家族在肝癌组织的表达情况；利用免疫共沉淀，染色质沉淀技术和甲基化测序技术研究Bcl-2家族基因启动子区域组蛋白乙酰化水平和CpG岛甲基化状况。进行人肝癌裸鼠移植瘤实验，探讨HDAC3和DNMT1特异抑制剂对肝癌的治疗作用。项目旨在研究ZBP-89和受其调控的HDAC3和DNMT1对Bcl-2家族基因的转录调控作用和表观遗传调控作用，揭示组蛋白乙酰化和基因甲基化在肝癌Bcl-2家族抑/促凋亡蛋白表达失衡及凋亡失衡的机制。项目的完成将阐明受ZBP-89、HDAC3和DNMT1调控的Bcl-2蛋白家族，及表观遗传酶抑制剂在肝癌凋亡治疗中的重要。

本项目拟探讨转录因子ZBP-89协同DNA甲基化酶对Bcl-2基因家族的表观调控影响，和基因启动子甲基化对细胞凋亡的影响，以及基因甲基化与肝癌标志物和治疗预后的关系。通过对肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC\PRF\5 和Huh-7和肝永生化细胞系的转录因子和甲基化酶和组蛋白去乙酰化酶的表达水平分析，发现DNMT3B在肝癌细胞中较高表达，DNMT1、DNMT3A和ZBP-89中肝癌细胞中有差异表达；而HDAC3的表达水平差异不大。通过对TCGA数据库中HCC患者癌组织和癌旁正常组织的表达谱数据分析，发现DNMT1与BCL2L1和BOK密切相关，而BBC3、BAX和BOK则与DNMT3A水平密切相关，另外BBC3还与DNMT3B水平密切相关。甲基化测序分析发现，抑凋亡基因BCL2A1, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L15和MCL1的TSS1500区域的低甲基化中肿瘤细胞中非常显著；促凋亡基因BAX，BBC3，BMF和BOK也出现低甲基化情况，而另一个促凋亡基因BID则出现高甲基化。在肝癌细胞系Hep3B中，癌细胞启动子CpG的低甲基化水平显著，而MIHA的BCL2家族成员有较高的甲基化水平，Hep3B启动子区域CpG的甲基化相对离散程度大，非癌细胞系MIHA则相对均一。 当肝癌细胞外源性高表达ZBP-89高表达后，BCL2A1基因TSS1500区域甲基化水平升高，BBC3基因的甲基化水平降低。采用ROC曲线下面积来判断诊断指标的敏感性和特异性时，我们发现BCL2A1 和BCL2L15的异常甲基化在肿瘤和非肿瘤组织中差异非常大，ROC面积超过 0.8，显示出非常高的特异性和敏感性，另外，BCL2L1, BBC3和BID等的ROC数值从0.65到0.79不等。进一步分析发现BCL2A1，BCL2L15和BBC3低甲基化是病人预后存活的危险因素。在应用CIMP作为指标进行验证时，高CIMP数值代表了病人预后的高危因素，该部分病人有更低的5年生存率。当用CIMP>3进行分组时，高CIMP组5年生存率低于10%，而低CIMP组的5年生存率为58.3%。我们初步得出结论：BCL2家族的启动子甲基化表型的差异与病人预后存活率密切相关，BCL2L1，BCL2L15和BBC3的甲基化水平可以作为病人预后的判断指标并指导用药。