转录因子ZBP-89调节促凋亡蛋白Bak表达的分子机制及在肝癌发生中的作用研究

研究发现肝癌组织低表达促凋亡蛋白Bak,不利于化疗药物诱导肝癌细胞凋亡，但其机制仍不清楚。本研究采取甲基化测序，染色质免疫沉淀方法检测bak启动子甲基化、组蛋白乙酰化水平。RNA干扰技术研究ZBP-89与DNA甲基化酶、组蛋白去乙酰化酶相互作用对Bak表达的影响。建立裸鼠移植瘤模型，研究腺病毒介导的转录因子ZBP-89对肝癌的治疗作用。通过研究转录因子ZBP-89介导bak基因启动子甲基化和组蛋白H3、H4乙酰化情况，以及ZBP-89和甲基化酶、组蛋白乙酰化酶相互作用机制。揭示转录因子ZBP-89激活bak基因转录，诱导肝癌细胞凋亡的机制。以及bak基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化水平对蛋白表达的影响。本研究意义在于揭示转录因子ZBP-89重新开启促凋亡基因bak表达，促进细胞凋亡的机制。阐明转录因子ZBP-89与组蛋白（去）乙酰化酶、甲基化酶相互作用对肝癌表观遗传治疗的可行性。

肝癌是非常高死亡率的恶性肿瘤之一。由于传统化疗方式的局限性，表观遗传治疗方法可能成为肝癌化学治疗的替代方法。我们首次报道转录因子ZBP-89诱导肝癌细胞Bak的表达，表观调控是否参与该诱导作用，目前仍然不清楚。本项目旨在研究ZBP-89调控Bak表达的表观遗传机制，深入探讨DNA甲基化转移酶（DNMT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）介导的ZBP-89对Bak的调控作用，进一步阐明ZBP-89与DNMT和/或HDAC的作用机制。.对肝癌病人组织蛋白分析表明：相对于癌旁组织，肝癌组织Bak和ZBP-89蛋白表达降低，而DNMT1和HDAC3表达升高。免疫共沉淀技术显示ZBP-89与HDAC3、DNMT1结合。实验结果也表明过表达的ZBP-89抑制HDACs和DNMTs的活性。ZBP-89调节的Bak表达可能是通过抑制HDACs活性和维持组蛋白H3和H4乙酰化水平实现的，另一方面， HDAC抑制剂（HDACi）VPA和TSA，DNMT抑制剂（DNMTi）Zebularine均可以诱导肝癌细胞Bak表达，此外，siRNA干扰HDAC3的表达同样可以诱导Bak表达。染色质免疫沉淀结果显示ZBP-89结合于Bak的启动子区域，从-3188bp到-3183bp，从-275到-49。ZBP-89抑制DNMT的活性，并抑制MeCP2结合基因组DNA。亚硫酸盐测序结果显示ZBP-89过表达可以影响Bak启动子CpG岛的甲基化状态，并促进其去甲基化。结果发现ZBP-89促进Pin1+/+细胞中HDAC3减少，而对Pin1−/−的细胞则没那么明显。说明Pin1在ZBP-89介导的HDAC3降低中的重要作用。IκB激酶 (IKK)抑制剂抑制 ZBP-89介导的HDAC3的降低；而SN50, p65/p50抑制多肽，则不影响HDAC3的降低。人肝癌细胞的裸鼠移植瘤研究结果表明ZBP-89蛋白和组蛋白抑制剂VPA和DNA甲基化酶抑制剂zebularine都能抑制肿瘤的生长，并诱导肿瘤组织Bak表达及细胞凋亡。.本研究揭示了ZBP-89调节Bak蛋白表达，及在肝癌细胞凋亡的表观遗传调控机制，探讨了ZBP-89联合Pin1经由IκB通路调节HDAC3蛋白水平的机制。本研究为肝癌表观遗传学的治疗提供研究基础和科学依据。