人类精子表面一种新型蛋白酶及其抑制剂的鉴定和功能研究

In mammalians, fertilization is the fusion of the two gemates and it is the start point to produce offspring. Proteases and protease inhibitors play important regulatory roles in the fertilization process. In our previous study,we isolated and identified a novel protease with gelatinolytic activity from human sperm.It only showed activity when it was free from the seminal plasma. Therefore,we assumed there exist a protease inhibitor which could specifically inhibitor this 28 kD protease.When the semen passing through the female reproductive tract,the inhibitor will gradually shed off from the sperm so that the protease could function, and finally to fertilize the oocyte. This study will focus on the distribution and its expression difference on sperm between the fertile people and the infertility, and finally to disclose its function in the fertilization. Furthermore, we will aslo identify the inhibitor which is specifically inhibit this protease, to show its biological roles.This study may provide a new insight into the fertilization process and a significant clinic diagnosis method for the infertility.

在哺乳动物中，受精是指两性生殖细胞的融合并且是生命的开始。在受精过程中，蛋白酶和蛋白酶抑制剂起着非常重要的调控作用。在我们的前期工作中，我们分离并鉴定了精子表面上一种新型的具有明胶活性的蛋白酶。它只在精子脱离精浆后才表现活性。因此我们推测精浆中存在着一种蛋白酶抑制剂，可以特异性地抑制这个大小为28kD的蛋白酶，当精液进入女性生殖道过程中，此抑制剂才逐渐从精子上脱离下来，这个蛋白酶开始发挥作用从而使精子完成与卵子受精的使命。本项目将系统地研究此蛋白酶的分布和在不育病人精子上的表达情况，阐明其在精卵受精中的作用；还将鉴定它的特异性抑制剂，阐述它的抑制作用和生物学功能，此项研究对受精过程提供一个新的视角，并且为临床诊断不育患者提供依据。

人类射精精子还不具有使卵子受精的能力，必须经过雌性生殖道或在体外用适合的培养液洗涤获能后才有受精能力。我们推测精子表面存在某种重要分子，在精浆存在下它的活性被抑制而使精子不具有受精能力，当精卵受精时精子脱离精浆才重新表现出活性。在体外受精实验室中，只有用培养液（如人类输卵管液HTF）洗涤过的精子才可以使卵子受精，我们以此作为切入点，采用一套优化后的纯化体系，从精子上分离出一种新型的30kD大小的蛋白酶。我们通过RP-HPLC结合MALDI TOF/TOF MS的方法鉴定发现它是具有明胶酶活性的前列腺特异性抗原(PSA)异构体，命名为PSA_isoform，它的C末端具有17个氨基酸的特殊序列区别于其他异构体。研究明确了该蛋白在男性的前列腺中表达，存在于前列腺、睾丸及精子表面。功能研究证实这个新型的蛋白酶具有调节精子穿越透明带的重要功能，并且此蛋白在体外受精(IVF)失败但单精子胞浆注射(ICSI)却受精病例的精子中表达量明显低于正常精子，因此这个蛋白表达的下降或缺失是引起体外受精失败的重要原因。本实验证实PSA_isoform蛋白是精子获能后协助精子穿透透明带的一种重要蛋白，临床上该蛋白的缺乏和减少是导致男性不育的重要因素，因此该蛋白可作为男性不育症的一个新的指标；同时缺乏该蛋白的精子不能完成受精，因此该蛋白也可作为人工辅助生殖IVF和ICSI技术选择的指标；此外该蛋白也是男性不育症的重要的药物筛选靶分子。