基于高通量测序对骆驼抗体库的多样性分析和数据挖掘及新纳米抗体的发现

The humoral immune response of the Camelidae is unique as these animals are the only known mammals that possess functional homodimeric heavy-chain antibodies (HCAbs) devoid of light chain naturally. Although the contribution of combination between heavy and light chain to the diversity of antibody repertoire was missing，the overall diversity was not lowered owing to the diverse germline VHH and specific mechanisms combined with unique structure of VHH CDR3. In contrast, it enlarged the antigen binding sites of HCAbs, especially, the sites which classical heteromeric antibodies can not easily accessible. For comprehensively understanding the mechanisms of antibody repertoire development in camelids，especially the composition and distribution of HCAbs in camelids humoral immune system，the newly developed high throughput sequencing (HTS) platform would be employed to deep analysis and characterizing of camel antibody repertoires. Meanwhile，we would develop novel large scale nanobody discovery platform based on HTS produced VHH sequences and data mining. The application of this project consisted following contents: (1) HTS analysis camel antibody repertoire, including VDJ segment germline analysis, the content ratio of IgG isotypes, VH(H) identification, frequency distribution of abundant CDRH3, BCR linage，somatic hypermutation and affinity maturation etc；(2) Development of bioinformatics analysis pipeline for handling vast camel antibody gene repertoire HTS data；(3) Development of nanobody discovery platform based on sequence frequency and ranking combined with data mining; (4) Evaluation the feasibility of HTS antibody discovery platform by analysis of the antigen binding specificity and affinity of HTS discovery interested nanobodies experimentally.

骆驼体液免疫系统是目前发现的唯一缺失轻链天然存在重链抗体的哺乳动物。尽管由于缺少重链和轻链的组合降低了其抗体库的多样性，但重链抗体可变区（也称纳米抗体）尤其是CDR3的特殊结构弥补了其多样性的不足，而且还扩大了重链抗体识别特殊抗原表位的能力。为了全面了解骆驼抗体独特的体液免疫系统的形成机制和多样性组成，特别是了解重链抗体在抗体库中的组成和分布，同时建立高效的基于序列深度分析的纳米抗体大规模发现技术，本项目以当前广泛采用的高通量测序（HTS）技术为基础，开展以下研究：(1)HTS分析骆驼抗体库中VDJ胚系基因的分布、IgG抗体亚型的比例、VH(H)序列和CDR3的长度分布、BCR谱系分布以及体细胞高突变和亲和力成熟等；(2)建立针对骆驼抗体HTS数据的分析方法；(3)建立基于HTS和VHH序列丰度和数据挖掘的纳米抗体发现平台；(4)实验测定候选抗体的抗原结合特性和亲和力，评价该技术的可行性。

骆驼体液免疫系统由于缺失存在轻链的重链抗体，其抗体库的形成存在独特之处。为了全面了解骆驼抗体独特的体液免疫系统的形成机制和多样性组成，特别是了解重链抗体在抗体库中的组成和分布，同时建立高效的基于序列深度分析的纳米抗体大规模发现技术，本项目采用Illumina MiSeq二代高通量测序技术，分别对CD47,FSHR和PD-L1免疫的骆驼VHH文库序列进行了高通量测序，采用了IMGT-HighV QUEST和AbMiningToolbox工具进行序列分析，确定了骆驼VHH的序列特征、CDR3长度分布、V(D)J 胚系基因片段的鉴定和分类，并分析了VHH突变文库与天然文库CDR3区氨基酸分布规律，获得了抗体库多样性的基本分子特征。 在基于高通量测序纳米抗体发现平台的建立方面，分被对CD47、FSHR和PD-L1免疫文库进行高通量测序分析，并与免疫前的文库VHH序列进行比较发现了部分免疫富集的VHH序列与其抗原结合之间存在一定的正相关，可以通过抗原免疫富集的序列发现新的纳米抗体，除此还分析了FSHR对VHH噬菌体展示文库筛选前后VHH序列高通量测序在鉴定纳米抗体中的应用。另外，探讨了蛋白质组学结合高通量测序技术，在CD47纳米抗体发现中的应用价值，发现了至少一株具有高亲和力结合活性的CD47纳米抗体。尽管本项目证明了高通量测序及结合蛋白质组学技术在纳米抗体鉴定和发现中的应用价值，但由于本研究涉及大数据的分析，需要自编一些适合本研究的软件分析工具，这项工作受限于我们专业背景和分析能力，因此，一些大数据的分析影响了我们的工作进度。今后如何联合相关技术人员共同开发适合免疫组学分析的软件和算法是当前该领域工作的重点和发展方向。