长非编码RNA AS1DHRS4调控基因表达的靶向和作用机制

DHRS4 [dehydrogenase/reductase (SDR family) member 4] gene encodes NRDR [NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase], which is a key enzyme for the endogenous synthesis of retinoic acid from vitamin A. Our previous studies have demonstrated that long noncoding RNA AS1DHRS4, the head-to-head antisense transcript to DHRS4, markedly regulated the expression of the DHRS4 gene cluster. AS1DHRS4 not only mediated the deacetylation of histone H3 and demethylation of H3K4 in cis for the DHRS4 gene, but also recruited repressive epigenetic modifiers EZH2, G9a and DNA methyltransferases in trans to the promoters of the downstream DHRS4L2 and DHRS4L1 genes, inducing local repressive histone modifications and DNA methylation. In this program, by combining pull-down assays of the biotin-tagged oligodeoxynucleotides, deep-sequencing, and proteomic analysis, we seek to identify further: 1 whether AS1DHRS4 acts only on the DHRS4 gene cluster; 2 the exact mechanisms of AS1DHRS4 targeting the promoters of the DHRS4 gene cluster, especially the promoters of DHRS4L2 and DHRS4L1 genes; 3 if other protein components are involved in the transcriptional regulation of AS1DHRS4; and 4. the functional domains of AS1DHRS4 sequence.

DHRS4基因编码的蛋白质NRDR，是体内维生素A向维甲酸转变的关键酶。我们前期的研究证明，长非编码RNA AS1DHRS4，即与DHRS4基因以头对头形式存在的反义转录本，不仅cis调节DHRS4基因，还trans调节DHRS4基因簇的另外两个同源基因DHRS4L2和DHRS4L1的转录。这种调节是AS1DHRS4通过募集抑制性蛋白修饰复合体，表观遗传调控各个基因启动子区域的染色质构象乃至DNA甲基化来完成的。本研究拟通过生物素标记的寡核酸沉淀，深度测序以及蛋白质组学等方法进一步阐明：1. AS1DHRS4是否特异性作用DHRS4基因簇，2. 决定AS1DHRS4与DHRS4基因簇的各个启动子区域特异性相互作用的靶向分子机制，3. 参与反义RNA调控作用的抑制性蛋白复合体成分，4. AS1DHRS4不同序列部分的不同功能。

长非编码RNA AS1DHRS4，即与DHRS4基因以头对头形式存在的反义转录本，不仅cis调节DHRS4基因，还trans调节DHRS4基因簇的另外两个同源基因DHRS4L2和DHRS4L1的转录。本研究通过（1）染色质免疫沉淀技术和甲基化特异性PCR检测发现，AS1DHRS4通过DNA甲基化协同组蛋白修饰调节DHRS4基因簇的启动子的转录活性；（2）经生物素标记的寡核酸沉淀AS1DHRS4-蛋白复合物，质谱分析鉴定AS1DHRS4结合募集的蛋白分子结果显示AS1DHRS4结合的蛋白复合物中量最多为结合核糖体和参与转录后修饰的蛋白；（3）克隆鉴定了不同哺乳动物DHRS4基因的反义转录本，发现恒河猴和小鼠中DHRS4-AS转录本促进DHRS4基因的转录，而在人肝细胞中则抑制DHRS4基因簇的转录活性，提示不同结构的反义RNA可能具有不同的调控效果。以上结果证实了DHRS4反义RNA对正义DHRS4基因簇在表观遗传学水平的调控效果，并为今后进一步研究反义RNA的调控基因表达的作用机制以及反义RNA在物种进化过程中的演变提供了资料。