高穿透LINC00511-siRNA靶向纳米微泡聚合物逆转三阴性乳腺癌化疗耐药的实验研究

Due to special molecular typing, triple negative breast cancer (TNBC) is absent of effective targeted therapy. Chemotherapy is the main systemic treatment at present, but the common chemoresistance can lead to treatment failure, tumor progression or metastasis, furthermore seriously affecting the survival rate of patients. Therefore, the main aim of this study is to improve the sensitivity of chemotherapy, reverse drug resistance and explore new targets. Long chain non-coding RNAs as a new regulatory molecule, which study of breast cancer has just started are related to the occurrence, development and chemoresistance. The expression level of LINC00511 in chemoresistant cells of TNBC was significantly higher than that of non-resistant cells. In previous studies, we had grasped the preparation of dural gene vector with nanobubbles (NBs) and the cell-penetrating peptides (CPPs). Based on the above, we want to construct targeted IR780-NB-CPPs-siLINC00511 polymer, with the targeting and fluorescence of IR780, and combined with UTMD technology. It has multiple functions of carrying siLINC00511, reversing drug resistance and ultrasound-fluorescence double modal imaging. We hope to evaluate the effect of silencing LINC00551 with the targeted polymer for reversing chemoresistance of TNBC by visual monitoring and set up a new strategy for the precision treatment of TNBC.

三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏有效的治疗靶点，化疗仍是全身治疗的主要方法，而化疗耐药是治疗失败的主要原因。因此，解决TNBC化疗耐药对于提高患者生存率具有重要意义。lncRNA在乳腺癌的发生、发展及耐药中起着重要作用，课题组前期研究发现LINC00511在TNBC耐药细胞中表达水平显著高于非耐药细胞。本研究拟针对LINC00511为基因沉默靶点，利用已掌握的纳米微泡（NBs）与细胞穿膜肽（CPPs）“基因双载体”的制备方法，联合具有肿瘤靶向性和荧光成像能力的IR780，构建高穿透靶向IR780-NB-CPPs-siLINC00511聚合物；在UTMD介导下，转染TNBC耐药细胞并沉默LINC00511，逆转化疗耐药性，同时在超声-荧光双模态成像下监测疗效。本课题将明确TNBC耐药治疗的新靶点，且首次将基因双载体应用于lncRNA在肿瘤耐药的研究，为TNBC耐药治疗提供新的思路和实验依据。

LINC00511在三阴性乳腺癌的发生、发展及耐药中发挥重要作用，参与细胞增殖分化及信号通路的调控;另外,LINC00511在TNBC顺铂耐药细胞中表达水平显著高于非耐药细胞。本项目通过低频超声（LFUS）联合高穿透载LINC00511-siRNA纳米微泡技术提高TNBC细胞的药物敏感性，将细胞穿膜肽（CPP）作为二级载体搭载LINC00511-siRNA构成CPPs-siRNA复合物,利用纳米微泡包裹CPPs-siRNA复合物构成仅有纳米级大小的高穿透载基因纳米复合物。该复合物在LFUS辐照下通过提高细胞膜的通透性进而增加基因的转染效率，有效地解决了非病毒基因载体转染效率低这一难题。首先,以磷脂复合物为原料、以CPP为二级载体，联合薄膜水化法和机械振荡法制备载LINC00511-siRNA-CPPs高穿透纳米微泡聚合物。此项目所用细胞株为人源三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231及其顺铂耐药细胞株MDA-MB-231/CDDP，采用CGZZ型低频超声基因转染治疗仪进行基因转染。随后，通过qRT-PCR实验在分子水平证实通过该转染方法能有效地降低LINC00511表达水平；此外，流式细胞术实验数据显示实验组基因转染效率明显增高。CCK-8实验结果表明敲低LINC00511基因后，TNBC细胞顺铂半数抑制率（IC50）明显降低，表明其药物敏感性显著增加。应用Jc-1实验和流式细胞仪分别定性和定量检测细胞凋亡水平的变化，结果显示治疗组细胞凋亡率明显增高。同时，Transwell实验证实治疗组细胞侵袭性和迁移能力明显低于阴性对照组。另外，基因组测序结果显示，基因治疗前后细胞mRNA和LINCRNA表达水平存在明显差异。最后，通过Western-blot实验证实LINC00511-siRNA治疗后，细胞凋亡相关蛋白Bax表达水平提高而bcl-2表达水平降低。基于上述研究成果课题组得出结论，高穿透载基因纳米微泡联合LFUS具有提高基因转染效率的功能，敲低LINC00511可以提高TNBC细胞药物敏感性。项目资助发表SCI收录论文3篇，另有投稿外审中1篇，资助发表中文核心期刊论文2篇，培养博士生1名、硕士生3名，其中1名硕士已经取得硕士学位，博士及2名硕士在读。项目经费各项支出基本与预算相符，剩余经费用于后续实验。