成牙诱导潜能的分子构成及再生牙的制备

Stem cell based tooth regeneration will have great clinical application in regenerative dental medicine in the near future. There are five types of tooth-derived mesenchymal stem cells that have been isolated and characterized so far. While these stem cells can be induced to differentiate into mesenchyme-derived tooth tissues, none of them possess tooth inductive capability, the odontogenic potential,to induce tissues of non-dental origin to form a tooth.Therefore, identification of the molecular components of odontogenic potential will be the prerequisite for future realization of stem cell based tooth regeneration in humans. In this application, built on our previous and preliminary studies, we will identify and characterize factors that constitute the odontogenic potential, and further confer dental pulp stem cells with odontogenic potential. Dental pulp stem cells that acquire odontogenic potential will be recombined with iPSCs to construct tooth germs and subject to kidney capsule culture in nude mice to generate tooth organs. Our ultimate goal is to develop cell-based strategies to replace missing teeth in humans. These studies will have great impact on the practice of human tooth regeneration in the near future, and will also have general implication in stem cell based tissue engineering.

人类牙齿的再生是一项极具应用前景、市场价值和社会效益的研究。人牙源性间充质干细胞不具备诱导牙齿发育潜能，只具备被诱导分化形成相关牙组织的能力，无法利用这些干细胞，像牙胚细胞的再生体系那样，重建完整的牙齿器官。因此，解析成牙诱导潜能的分子构成已经成为牙齿再生研究中亟待解决的科学问题。本项目将在前期研究的基础上，解析成牙诱导潜能的分子构成，通过RNAi修饰、过表达相关转录因子和添加生长因子蛋白等，赋予牙髓干细胞诱导牙齿发育潜能，使牙髓干细胞获得牙胚细胞的特性，与iPSCs混合重组，构建组织工程牙胚，植入裸鼠肾囊膜下培育，尝试异位重建完整的牙齿器官，并进行再生牙的生物学特性评估。研究结果将为理解牙齿再生的机理提供实验数据，为进一步的临床研究奠定理论和技术基础，对干细胞在组织工程领域中的应用研究也有普遍的意义。

基于干细胞的全牙再生是牙齿更换的理想方式。生物工程牙齿需要上皮与间充质来源的干细胞，其挑战之一是鉴定诱导成牙潜能的分子构成，并赋予上皮或间充质源性干细胞具备诱导成牙潜能。小鼠是研究人类牙齿发育与再生的模型。小鼠牙齿发育过程中，诱导牙齿发育的潜能最初在牙上皮，E12.5后转移到牙胚间充质。E13.5和E14.5的牙胚间充质打散后重聚，仍具有诱导成牙的潜能，体外培养8h（E14.5牙胚间充质细胞为24h）后诱导潜能丢失，培养9d（E14.5牙胚间充质细胞为48h）后完全丧失成牙能力的特点，利用RNA测序的方法筛选出差异基因，并深入研究了其中备选基因Sfrp5进行功能验证及机制研究。.首先在体外培养的E13.5 mMMC中，通过添加外源SFRP5蛋白的方式研究该基因是否具有维持乃至挽救mMMC诱导成牙潜能的能力。结果发现，外源SFRP5不仅有效维持而且挽救mMMC诱导第二鳃弓上皮牙向分化的能力。进一步研究发现，外源SFRP5通过维持及挽救mMMC中Wnt/β-catenin活性及相关牙间充质关键转录因子的表达，进而有效维持和挽救牙间充质细胞的诱导成牙潜能。进一步构建了pMes-Sfrp5小鼠，并与Wnt1-Cre小鼠交配，获得Wnt1-Cre;pMes-Sfrp5小鼠，实现在颅神经嵴来源的间充质细胞包括牙间充质细胞中过表达Sfrp5。将E13.5 Wnt1-Cre;pMes-Sfrp5小鼠胚胎牙间充质打散成单细胞后进行体外培养，并验证过表达Sfrp5对体外培养的mMMC诱导成牙潜能的影响。结果发现，过表达Sfrp5同样有效维持了体外培养的mMMC诱导第二鳃弓上皮牙向分化的能力，同时也维持Msx1、Pax9、Lhx6等牙间充质关键转录因子的表达及Wnt/β-catenin通路活性水平。最后，利用RNA-Seq和ChIP-Seq技术筛选了Sfrp5与Wnt/β-catenin互作调控的mMMC诱导成牙潜能的下游基因14个，其中有6个基因已被证明与牙齿发育相关，为Sfrp5与Wnt/β-catenin调控mMMC诱导成牙潜能的备选下游调控因子。.以上结果证实，Sfrp5是构成mMMC诱导成牙潜能分子构成的关键因子之一。研究结果深入理解Sfrp5介导的Wnt信号在调控小鼠牙间充质细胞诱导成牙潜能中的作用及其机制，为将来利用体外培养的干细胞实现人类全牙再生提供理论依据。.