小麦静息巯基氧化酶的重组表达及其强化面筋网络结构机理

Development of enzyme with good performance instead of chemical oxidizing agents to improve flour-processing quality is an important choice for flour products industry. Wheat quiescin sulfhydryl oxidase (wQSOX), an enzyme from FAD-dependent sulfhydryl oxidase family, which can efficiently catalyze disulfide cross-linking of protein, has the potential to develop into a new flour improver. In this project, recombinant wQSOX will be prepared by gene engineering technology, and its catalytic properties will be determined. Then the effects of addition of wQSOX on sulfhydryl content, hydrophobic properties, secondary structure, and gluten network structure of gluten will be investigated. Moreover, 1Dx5-N, a N-terminal domain of high molecular glutenin subunit, will be chose as a substrate to explore the contribution of wQSOX catalyzing the disulfide cross-linking of 1Dx5-N from two oxidation pathways of the disulfides transfer-exchange and direct oxidation by hydrogen peroxide, respectively, which will help to systematically elucidate the molecular mechanism of wQSOX strengthening gluten network structure. On this basis, two multigrains with different health benefits will be used to establish new methods of wQSOX improving quality of multigrain bread. These results will not only enrich the academic connotation involved in quiescin sulfhydryl oxidase (QSOX) and flour products quality, but also promote the application of wQSOX in food industries especially in flour products industry. Meanwhile, the project will also drive the green development of flour products industry in China.

开发性能良好的面粉改良酶制剂替代化学改良剂是目前面制品加工行业的研究重点。小麦静息巯基氧化酶（wQSOX）是能够高效催化蛋白质二硫键交联的黄素依赖型巯基氧化酶，具备发展成为新型面粉改良酶制剂的潜力。本项目利用基因工程技术制备重组wQSOX，在掌握wQSOX催化特性基础上，探究添加wQSOX对面筋蛋白巯基含量、疏水特性、二级结构和面筋网络结构等方面的影响。进一步以高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5-N为底物，从二硫键转移交换途径和过氧化氢直接氧化途径探究wQSOX催化1Dx5-N二硫键交联的贡献，阐明wQSOX强化面筋网络结构的分子机制。在此基础上，选择两种具有不同功效的杂粮为原料，建立wQSOX改善杂粮面包品质的新方法。研究结果不仅可以丰富静息巯基氧化酶（QSOX）与面制品品质相关基础研究的学术内容，而且能够促进wQSOX在面制品等食品工业领域中的应用，推动我国面制品行业的绿色发展。

开发性能良好的面粉改良酶制剂替代化学改良剂是目前面制品加工行业的研究重点。静息巯基氧化酶（QSOX）是能够高效催化蛋白质二硫键交联的黄素依赖型巯基氧化酶，具备发展成为新型面粉改良酶制剂的潜力。本项目利用基因工程技术合成水稻QSOX（rQSOX）基因，通过大肠杆菌原核体系构建重组蛋白rQSOX表达系统，在建立其诱导表达和纯化条件后精制重组rQSOX，并探究pH、温度和底物等对酶活性影响，明确rQSOX的酶学性质；进一步探究重组酶对面粉粉质特性、面团流变特性及馒头和面包等制品质构特性影响，掌握rQSOX对面粉加工品质影响规律；在此基础上，进一步从面筋蛋白结构、聚集体组成以及影响面筋网络交联的共价键变化等角度，探讨rQSOX强化面筋网络结构的相关机制。结果表明，rQSOX基因全长1539 bp，由513个氨基酸编码而成，同时包含信号肽和跨膜区序列；构建了去除信号肽和跨膜序列的pMAL-C5X-mbp-rqsox重组质粒，实现了rQSOX在Rosetta gamiB(DE3)中的可溶性重组表达，带MBP标签的重组MBP-rQSOX蛋白最适表达条件为25℃、IPTG浓度0.3 mmol/L、诱导时间6 h。rQSOX能够催化氧化TCEP、DTT和Cys等小分子底物，其对DTT选择特异性最强，催化氧化DTT过程伴随溶液氧分子的消耗和H2O2的生成，在所选条件下，催化DTT的比酶活性为1.96 U/mg；以DTT为底物，得到了rQSOX催化氧化DTT的最适反应温度为60℃，80℃孵育1 h仍能保留50%以上酶活性；最适pH为8.0，pH 7.0-9.0范围内具有较好稳定性。添加rQSOX能够延长面粉的稳定时间，降低面粉弱化度，提高面团的粘弹性模量，增大馒头和面包等制品的比容并改善其硬度和弹性等质构特性，即表现出了改善面粉加工品质作用；这一改善作用主要归因于酶添加后强化了面筋蛋白网络结构，提高了GMP的含量及其超大分子量聚集体比例，增加了面筋蛋白二级结构β-转角含量。而面团中过氧化氢含量的提高以及面筋蛋白自由巯基含量的降低及二酪氨酸含量的提高表明，rQSOX改善面粉加工品质机理应与其直接催化面筋蛋白二硫键交联以及反应副产物H2O2间接氧化面筋交联有关。研究结果为新型面粉改良酶制剂的开发奠定了理论基础。