年龄相关性黄斑变性光感受器细胞神经保护的分子机制研究

Age-related macular degenation (AMD) leads to retinal photoreceptors apotosis and cause blindness in the aged people. Oxidative stress was considered to be an important and also indepentent risk factor for AMD development, due to pathylogical calcium influx caused photoreceptor appotosis. In this project, we propose to stablize intracellualer calcium level by blocking mitochochia calcium-induced-calcium-influx mechanism to reduce apoptosis and save vision. In our preliminary data, we found that NAE could block calcium-induced-calcium-channel RyR during pathological oxiadation,and also protect mitochondia damage as well as photoreceptors damage during oxidation insult. Hereby in this project, we will test our hypothesis that NAE has neuroprotective effect due to control calcium overload during oxidative stress, by using eletrophysiology, immuonohistochemistry, biochemitry, imaging and behavior study.

视网膜年龄相关性黄斑变性最终将导致视网膜光感受器细胞的不可逆死亡。由氧应激反应等因素所致视网膜光感受器细胞内钙离子浓度升高,会激活线粒体内源性凋亡途径，导致光感受器凋亡。我们将从神经保护角度出发，提出稳定光感受器细胞内钙的一条途径，即通过抑制光感受器在病理状态下的钙离子正反馈增高效应，减少钙超载所致的细胞凋亡。前期工作中我们已验证了光感受器中有钙正反馈通道RyR的表达，电生理实验的初步结果表明N-酰基乙醇胺（NAE）对RyR有抑制作用，减少钙的正反馈。我们已经在离体实验上检测到NAE对光感受器细胞在氧应激条件下有保护作用，并检验到NAE抑制线粒体因氧化应激钙过载所导致的崩解，阻碍了内源性的线粒体凋亡途径。将通过在体的行为学实验观察NAE对AMD模型转基因小鼠的视功能保护作用。本项目中提出针对视网膜的光感受器神经保护途径将为AMD的治疗提供新的思路。

视网膜年龄相关性黄斑变性（AMD）最终将会导致视网膜光感受器细胞的不可逆死亡。 在本研究中，我们运用了N-亚硝基-N-甲基脲（MNU）诱导的小鼠视网膜退行性病变模型，初步探讨了该模型中视网膜的形态、血管和电生理特征及退行性病变机制。 . 给予烷化剂药物MNU后，行冰冻切片免疫荧光染色，观察到MNU诱导后光感受器细胞末梢损伤、双极细胞树突明显退缩、PSD95标记的光感受器细胞末梢带逐渐变窄，我们也观察到线粒体损伤和光感受器细胞氧化损伤的情况。用免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达水平，结果显示在给MNU后，线粒体标记蛋白HSP60和COX4表达迅速下降。采用全视网膜铺片免疫荧光染色，观察到神经节细胞数量的减少和视网膜血管壁破坏，见大量膨大的末梢血管丛样结构。视网膜血管形态的破坏。采用透射电镜，观察MNU造模后线粒体的数量急剧下降，残余的线粒体结构出现肿胀只见线粒体的膜结构，内部大量空泡等视网膜细胞超微结构变化。采用视网膜电图ERG检测小鼠的全视网膜电生理改变，给MNU后第3天，全视野ERG结果显示：最大混合反应的a波和b波波幅均明显下降。薄片膜片钳技术记录，ON型视杆双极细胞的模拟对光反应消失。. 给予大麻素受体1抑制剂SR141716A（SR1）干预后，与MNU组比较，MNU+SR1的外核层厚度更厚，胶质增生不明显。全视网膜铺片免疫荧光染色血管显示：MNU+SR1组的大血管损伤轻，只见少量的异常末梢血管丛。视网膜冰冻切片观察MNU加SR1干预后，PKC标记的双极细胞树突大部分可见。薄片膜片钳技术记录：ON型视杆细胞对MNU的损伤比OFF型双极细胞更敏感。SR1能缓解MNU诱导的的视杆双极细胞电活动损伤，给予SR1后视杆双极细胞的模拟对光反应恢复。SR1能部分缓解MNU诱导的光感受器损伤和及其对下游双极细胞的影响。. 本项目中提出针对视网膜的光感受器细胞保护途径将为AMD的治疗提供新思路。我们研究揭示了大麻素受体1抑制剂SR141716A（SR1）可以缓解MNU诱导视网膜退行性病变模型的光感受器损伤。