miR-375致胚胎心脏畸形的作用与机制研究

The expression of miR-375 was significantly up-regulated expression in the fetal myocardial tissues samples with ventricular septal defects from aborted human embryos. It is highly homologous and its function in the heart development is unknown. Our further studies revealed that: 1) Overexpression of miR-375 can induced zebrafish cardiac malformation; 2) The results of bioinformatics analysis and microarray and luciferase reporter technology showed that Notch2 was its candidate target gene; 3) The key genes (Notch2、Dll1、Hey2) of Notch signaling pathway was significantly downregulated in the fetal myocardial tissues samples with ventricular septal defects. These results suggest that the mechanism of miR-375 induced zebrafish cardiac malformation may be related to the Notch signaling pathway. In this study，we will investigate the effect of miR-375 on zebrafish cardiac malformation and Notch expression changes. Further we in-depth analysis the mechanism of miR-375 induced zebrafish cardiac malformation with overexpression and suppression techniques at the cellular level. This study will provide new a target to combat congenital heart disease.

miR-375 是我们筛选发现、高表达于室间隔缺损胚胎心肌组织中、高度保守的、在心脏发育中功能未知的miRNA。前期研究发现：过表达miR-375可致斑马鱼心脏畸形；生物信息学分析、基因芯片及萤光素酶报告实验均提示Notch2是miR-375 的靶基因，且Notch信号通路在室间隔缺损胚胎心肌组织中也受到明显抑制（Notch2、Dll1、Hey2表达下调），与miR-375表达变化方向相反，提示miR-375致胚胎心脏畸形的机制可能与Notch信号通路有关。本研究拟：以斑马鱼、P19细胞为研究工具，通过过表达和表达抑制策略，进一步评估miR-375与斑马鱼胚胎心脏畸形及Notch2的关系；并以Notch信号通路为线索，应用挽救策略，深入分析miR-375致胚胎心脏畸形的机制。本研究国内外尚无报道，具有源头创新性，可为先天性心脏病的早期防治提供新的干预靶标。

先天性心脏病是新生儿期最常见的先天畸形之一，是导致人类孕期流产、死胎和新生儿发育缺陷甚至死亡的主要原因之一，严重危害着人类的健康和生存质量，给家庭和社会带来巨大的负担。因此，从基因和分子水平探索胚胎心脏形成及发育机制成为防治先天性心脏病基础研究新方向之一。本研究小组前期通过生物芯片技术筛选发现，miR-375基因在室间隔缺损胚胎心肌组织中的表达丰度显著高于正常人工流产胚胎心肌组织，随后我们采用实时荧光定量PCR验证了这一结果；另外我们还发现miR-375在先天性心脏病胎儿的孕母血液中也呈现高表达，提示miR-375很有可能在胚胎心脏发育过程中发挥着重要作用。但miR-375致胚胎心脏发育畸形的功能与机制研究目前并无文献报道。鉴于P19细胞和斑马鱼是心脏发育分子机制研究的经典模型，本研究借助上述模型，通过改变miR-375表达水平，探讨了miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡、分化的影响，评价了其在斑马鱼胚胎心脏发育中的功能，并初步分析了miR-375下游作用的靶标。结果显示：①miR-375过表达可致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形，死亡率、畸形率均增加，心率降低；miR-375过表达可致斑马鱼心脏组织中Notch1、Notch2及hey2基因表达下调。②miR-375过表达抑制了P19细胞的增殖；抑制P19细胞进入S期，凋亡相关的Bax/Bcl-2比值增高，细胞凋亡增加；miR-375过表达可抑制P19细胞向心肌细胞的分化，心肌标记物的表达量在细胞分化过程中逐渐升高，但就某一分化点而言，心肌标记物表达量在miR-375过表达组中较对照组低。③Notch2是miR-375的下游靶标，miR-375过表达可抑制Notch信号通路中关键基因的表达。本研究获得了较多有用的实验依据，为后续研究提供了新的线索和依据，为先天性心脏病发病机制的基础研究提供新线索。目前已发表SCI论文1篇，待发表SCI论文2篇，协助培养研究生两名。