miR-20b调节BMP信号通路致胚胎心脏畸形的机制研究

The expression of miR-20b was significantly up-regulated in the fetal myocardial tissues samples with ventricular septal defects from aborted human embryos. Our previous studies found that: (1) Overexpression of miR-20b can induced zebrafish cardiac malformation; (2) The results of bioinformatics analysis and luciferase reporter technology showed that BMPR2 is directly targeted by miR-20b; (3) The key genes (BMPR2、ALK3、Nkx2.5、GATA4) expression of BMP signaling pathway was significantly downregulated in the fetal myocardial tissues samples with ventricular septal defects. These results suggest that the mechanism of miR-20b induced zebrafish cardiac malformation may be related to the BMP signaling pathway.In this study，we will investigate the effect of miR-20b overexpression and silencing on zebrafish cardiac malformation and gene expression changes. We will demonstrate the mechanism of miR-20b induced zebrafish cardiac malformation by overexpression and silencing of BMPR2.Furtherly, we in-depth analysis the mechanism of miR-20b induced zebrafish cardiac malformation with overexpression and suppression techniques at the cellular level. This study will provide new intervention targets and clues for the prevention and treatment of congenital heart disease.

miR-20b是我们筛选发现的、在室缺流产胚胎心肌组织中表达显著上调的miRNA，其致胚胎心脏发育畸形及机制研究尚无文献报道。我们前期发现：miR-20b过表达可致斑马鱼出现心脏畸形表型，生物信息学分析及荧光素酶报告基因系统检测结果发现BMPR2是miR-20b的靶基因，且室缺胚胎心肌组织中BMP信号通路也明显受到抑制（BMPR2、ALK3、Nkx2.5、GATA4表达下调），提示miR-20b致胚胎心脏发育畸形的机制可能与BMP信号通路有关。本研究拟：观察miR-20b过表达、表达沉默与斑马鱼胚胎心脏畸形及BMPR2的表达变化；将BMPR2基因过表达、表达沉默，以论证miR-20b致斑马鱼胚胎心脏畸形的BMPR2机制；进一步在细胞水平，采用基因过表达技术及miRNA海绵体技术，深入分析miR-20b致胚胎心脏发育畸形的机制。本研究具有源头创新性，可为先心病的防治提供新的干预靶标及线索。

心脏是胚胎发育过程中第一个发挥功能的器官，其正常发育对胚胎发育起着重要的作用。心脏的发育是一个极其复杂和精细的过程，涉及不同时间和空间众多基因的顺序表达及多条信号通路的参与，以保证胚胎心脏协调发育。由于心脏发育畸形通常导致流产、死胎、新生儿死亡等，给家庭和社会带来沉重的负担，因此有关胚胎心脏畸形的生物学研究受到广泛重视。.miR-20b是我们筛选发现的、在室缺流产胚胎心肌组织中表达显著上调的miRNA。前期研究中，发现：miR-20b过表达可致斑马鱼出现心脏畸形表型；BMPR2是miR-20b的靶基因，室间隔缺损心肌组织中BMP信号通路也明显受到抑制（BMPR2、ALK3、Nkx2.5、GATA4表达下调），提示miR-20b致胚胎心脏发育畸形的机制可能与BMP信号通路有关。本研究拟在前期研究基础上，在体观察miR-20b过表达、表达沉默与斑马鱼胚胎心脏畸形、BMP信号通路变化间的关系；进一步在细胞水平，深入分析miR-20b致胚胎心脏发育畸形的机制。.通过斑马鱼在体实验研究，结果发现: ①过表达miR-20b导致斑马鱼出现心包水肿，心房、心室位置异常，影响心房、心室的分化，及房室通道发育，且发现miR-20b过表达、BMPR2的表达减弱。②miR-20b沉默对斑马鱼胚胎心脏发育没有影响。③BMPR2过表达对斑马鱼胚胎心脏发育没有影响。④BMPR2沉默时导致斑马鱼出现未环化的线性心管、心包水肿，心脏环化不完全，心房心室的位置异常，影响心房、心室的分化，心率的下降。.通过P19细胞体外实验研究，我们发现：①miR-20b过表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，并且通过抑制Bambi基因表达兴奋BMP信号通路，从而达到促进P19细胞分化成为心肌细胞的作用。②miR-20b过表达可能对心肌细胞线粒体功能有一定程度的损害，引起ROS升高、膜电位下降，ATP含量升高。③miR-20b表达沉默具有抑制P19细胞分化、凋亡，降低BMP信号通路表达的作用，并对于线粒体正常功能的维持也有一定帮助。.鉴于新生一周内小鼠具有心脏再生能力，选取出生第1、6、7天小鼠心脏组织，采用数字基因表达谱及高通量测序技术筛选差异表达基因及miRNAs，通过Real-time PCR验证差异表达的基因及miRNAs，本研究可为心脏组织再生研究提供新的线索，为先心病的治疗提供新的靶标。